di BASE E TRASLAZIONALE UROLOGIA

modello Sperimentale di umani corpi cavernosi il rilassamento della muscolatura liscia

Rommel P. RegadasI; Maria E. A. MoraesII; Francisco J. C. MesquitaI; Joao B. G. CerqueiraI; Lucio F. Gonzaga-SilvaI

IDepartment di Chirurgia, Scuola di Medicina, Università Federale del Ceará, Fortaleza, Ceara, Brasile
IIDepartment di Farmacologia, facoltà di Medicina, Università Federale del Ceará, Fortaleza, Ceara, Brasile,

in Corrispondenza di

ABSTRACT

Scopo: Descrivere una tecnica per la raccolta in blocco del corpo cavernoso, dell’arteria cavernosa e dell’uretra da donatori di organi trapiantati e esperimenti di rilassamento della contrazione con la muscolatura liscia del corpo cavernoso.
Materiali e metodi: Il corpo cavernoso è stato sezionato fino al punto di attacco con il pene crus. Un segmento di 3 cm (corpo cavernoso e uretra) è stato isolato e posto in tampone di trasporto sterile ghiacciato. Sotto ingrandimento, l’arteria cavernosa è stata sezionata. Così, sono stati ottenuti frammenti di 2 cm di arteria cavernosa e corpo cavernoso. Strisce di 3 x 3 x 8 mm3 sono state poi montate verticalmente in un dispositivo a bagno d’organo isolato. Le contrazioni sono state misurate isometricamente con un trasduttore di spostamento della forza Narco-Biosystems (modello F-60, Narco-Biosystems, Houston, TX, USA) e registrate su un poligrafo del modello di scrivania Narco-Biosystems a 4 canali.
Risultati: La fenilefrina (1µM) è stata utilizzata per indurre contrazioni toniche nel corpo cavernoso (tensione 3 – 5 g) e nell’arteria cavernosa (tensione 0,5 – 1 g) fino a raggiungere un plateau. Dopo la precontrazione, i rilassanti muscolari lisci sono stati utilizzati per produrre curve di risposta al rilassamento (da 10-12M a 10-4 M). Il nitroprussiato di sodio è stato usato come controllo del rilassamento.
Conclusione: La tecnica di raccolta e il modello di contrazione-rilassamento della muscolatura liscia descritto in questo studio hanno dimostrato di essere strumenti utili nella ricerca di nuovi farmaci per il trattamento della disfunzione erettile umana.

Parole chiave: pene; arteria cavernosa; erezione del pene; sperimentale ;disfunzione erettile

INTRODUZIONE

La disfunzione erettile (DE) colpisce circa 150 milioni di persone in tutto il mondo. La prevalenza di ED in Brasile è alta: più del 40% degli uomini brasiliani tra i 40 ei 70 anni soffre di ED e più di un milione di nuovi casi sono registrati ogni anno 1,2.

Sebbene gli inibitori della fosfodiesterasi di tipo 5 (PDE-5) abbiano rivoluzionato il trattamento della disfunzione erettile, molti pazienti, soprattutto quelli con disfunzione endoteliale (56% dei casi), non beneficiano di questa forma di terapia 3.

Attualmente molti studi sono condotti utilizzando donatori di ossido nitrico (NO), attivatori di guanilil ciclasi (sia isoforme intracellulari solubili che isoforme legate alla membrana), agonisti dei canali ionici e inibitori della RhoA-chinasi al fine di formulare nuovi farmaci con diversi meccanismi d’azione per trattare questa popolazione di pazienti 4,5.

La stragrande maggioranza di questi studi impiega corpi cavernosi di ratto e coniglio a causa della difficoltà nell’ottenere campioni di tessuto umano 5-7. Tuttavia, presso il nostro servizio di urologia, studi sperimentali su ED sono in corso dal 2004 utilizzando tessuti di corpi cavernosi umani provenienti da donatori di organi.

Lo scopo del presente studio era quello di fornire una descrizione dettagliata della tecnica utilizzata per la raccolta in blocco del corpo cavernoso, dell’arteria cavernosa e dell’uretra dei donatori di organi trapiantati e dei metodi utilizzati negli esperimenti di contrazione-rilassamento con la muscolatura liscia del corpo cavernoso.

MATERIALI E METODI

Tutti i protocolli di studio sono stati precedentemente approvati dal Comitato etico di ricerca sui soggetti umani dell’Università federale del Ceará e dal Comitato etico di ricerca nazionale del Ministero della Salute brasiliano.

Dopo l’autorizzazione della famiglia, il corpo cavernoso umano è stato ottenuto da donatori di cadaveri (< 40 anni) durante l’intervento chirurgico per il trapianto di organi.

Dopo la rimozione del cuore, del fegato e dei reni e attraverso la stessa incisione (pubica xifoide), il corpo cavernoso si trovava sopra la sinfisi pubica mediante approccio ipodermico digitale. Il corpo cavernoso è stato sezionato fino al punto di attacco con il ramuschihiopubico (crus penis) (Figura-1).

Un segmento di 3 cm comprendente il corpo cavernoso e l’uretra è stato isolato in blocco (Figura-2). Al termine della procedura non è stata praticata alcuna ulteriore incisione esterna. Successivamente, i tessuti sono stati collocati in tampone di trasporto sterile ghiacciato (soluzione Collins) e trattati entro 1 ora dalla raccolta.

I campioni sono stati elaborati con ingrandimento stereoscopico. L’intera arteria cavernosa al centro del corpo cavernoso è stata sezionata e isolata dai tessuti cavernosi circostanti (Figura-3). Quindi i tessuti cavernosi sono stati separati dai tessuti connettivi e dalla tunica albuginea. Pertanto, sono stati ottenuti frammenti di 2 cm di ciascuna arteria cavernosa e corpo cavernoso.

I frammenti del corpo cavernoso sono stati tagliati in strisce di circa 3 x 3 x 8 mm3 e montati verticalmente sotto tensione di riposo di 1g. L’arteria cavernosa è stata tagliata in anelli da 5 mm e montata orizzontalmente sotto 0,2 g di tensione a riposo. I tessuti sono stati mantenuti in camere d’organo da 5 mL contenenti mezzo di Krebs-Henseleit composto da 114,6 mm NaCl, 4,96 mM KCl, 1,3 mM MgSO4, 2,0 mM CaCl2, 1,23 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3 e 3,6 mm glucosio, arricchito con 10 µM guanetidina e 10 µM indometacina (pH 7,4, 37ºC, gasato con 5% CO2 e 95% O2).

I tessuti sono stati lasciati equilibrare per 90 min con lavaggio a intervalli di 15 min. La tensione è stata misurata da un trasduttore isometrico (Narco-Biosistemi F – 60 collegati a un poligrafo modello desk a 4 canali) (Figura-4).

Un micromolo fenilefrina è stato aggiunto ai bagni per ottenere contrazioni muscolari lisce submassimali del 60-70%. Successivamente, sono state tracciate curve concentrazione-risposta (da 10-8M a 10-2 M) a rilassanti muscolari lisci o nitroprussiato di sodio (SNP), un donatore di ossido nitrico, per verificare l’integrità funzionale endoteliale.

RISULTATI

La fenilefrina (1µM) è stata utilizzata per indurre contrazioni toniche nel corpo cavernoso (tensione 3-5 g) e nell’arteria cavernosa (tensione 0,5 – 1 g) fino a raggiungere un plateau. Dopo la precontrazione, i rilassanti muscolari lisci sono stati utilizzati per produrre curve di risposta al rilassamento (da 10-12M a 10-4 M). SNP è stato usato come controllo del rilassamento.Un certo numero di sostanze chimiche sono state utilizzate nel nostro laboratorio per indurre il rilassamento della muscolatura liscia, tra cui RuC13, un donatore di ossido nitrico. Rilassa completamente il corpo cavernoso umano e l’arteria cavernosa raggiungendo un Emax del 100% e un EC50 di 6,4 ± 0,14 (Figura-5).

Utilizzando preparazioni di corpi cavernosi con endotelio intatto da donatori umani sotto i 40 anni senza storia di disfunzione erettile o fattori di rischio cardiovascolare (ad esempio diabete, ipertensione e dislipidemie), questo modello fisio-farmacologico si è rivelato uno strumento interessante nella ricerca di nuovi farmaci per il trattamento della disfunzione erettile umana.

Gli inibitori della PDE-5 hanno rivoluzionato il trattamento della disfunzione erettile. Tuttavia, molti pazienti con ED soffrono anche di disfunzione endoteliale (56%) e quindi non rispondono a questa classe di farmaci 3.

La disfunzione endoteliale è spesso osservata in pazienti con comorbidità come ipertensione arteriosa e diabete mellito. È caratterizzato da una carenza nella produzione endogena di n.8.

Nel vero ED, il diabete, l’ipertensione e la dislipidemia (componenti della sindrome metabolica) tendono ad essere associati a disfunzione endoteliale. ED è stato anche segnalato per essere un marker per la malattia arteriosa cardiovascolare 9.

La ricerca di nuovi farmaci in grado di aumentare la disponibilità di NO endogeni è stata una sfida considerevole. Negli ultimi decenni sono stati utilizzati diversi modelli sperimentali basati su ratto, coniglio e corpo cavernoso umano 6,7,10,11.

Utilizzando corpi cavernosi in vivo e altri tessuti (ad esempio piastrine) da specie come ratti, conigli e umani, Peng Wang et al. 12 ha concluso che, nonostante la cinetica e le caratteristiche enzimatiche simili, diverse PDE hanno sensibilità diverse agli inibitori. Questo dovrebbe essere preso in considerazione quando si lavora con modelli sperimentali di questo tipo.

Il nostro modello sperimentale ha impiegato tessuti sani di corpi cavernosi da giovani donatori di cadaveri uccisi da traumi o ictus al fine di ridurre al minimo la preoccupazione per la distorsione dei risultati causata da tessuti campione di cattive condizioni.

Al contrario, in uno studio che utilizza un modello di corpo cavernoso umano simile per la valutazione dell’effetto del sildenafil sull’inibizione enzimatica della PDE e il conseguente rilassamento della muscolatura liscia, sono stati ottenuti campioni da pazienti con ED durante l’intervento chirurgico per l’impianto di protesi peniena, quindi sembra probabile che in questo caso la maggior parte dei soggetti presentasse una lesione endoteliale di

Un’altra preoccupazione in questo campo di ricerca è la disponibilità di tessuti per eseguire gli esperimenti. Nel Ceará vengono effettuati otto trapianti di organi ogni mese, consentendo di completare gli studi senza interruzioni importanti.

Seidler et al. 4 ha lavorato su un modello simile utilizzando corpi cavernosi donati da pazienti sottoposti a chirurgia di riassegnazione del sesso come trattamento per il transessualismo e il disturbo dell’identità di genere. Nonostante le buone condizioni dei tessuti, il piccolo numero di uomini che si sottopongono a questo tipo di procedura limita la possibilità di raccogliere tessuto sufficiente per il lavoro sperimentale.

Il presente documento presenta un modello completo per la raccolta di tessuti di corpi cavernosi umani e per l’esecuzione di esperimenti di rilassamento della muscolatura liscia in vivo. Il corpo cavernoso umano sano viene rimosso dai donatori di cadaveri e sottoposto a esperimenti in bagni isolati. La tecnica consente di sezionare e isolare il corpo cavernoso, l’arteria cavernosa e l’uretra.

L’importanza della tecnica risiede nel fatto che consente di testare una serie di nuovi farmaci, tra cui donatori stabili NO, attivatori di guanilil ciclasi e inibitori della RhoA-chinasi, sul corpo cavernoso della muscolatura liscia, sulle arterie del pene e sull’uretra 7,12-15.

CONCLUSIONE

Questo modello sperimentale prevede la dissezione, la raccolta, l’isolamento e la conservazione del corpo cavernoso umano, dell’arteria cavernosa e dell’uretra in condizioni ideali insieme agli studi fisio-farmacologici di accompagnamento. La fattibilità e la riproducibilità del modello lo rendono uno strumento attraente nella ricerca di nuovi farmaci per il trattamento della disfunzione erettile umana.

CONFLITTO DI INTERESSI

Nessuno dichiarato.

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Corrispondenza di
Dr. Rommel Prata Regadas
Dr. Ratisbona, 208, Fatima
Fortaleza, Ceará, 60411-220, Brasile
Fax: + 55 85 3366-8064
E-mail: [email protected]

Accettato dopo revisione: 20 gennaio 2010

COMMENTO EDITORIALE

L’erezione del pene è un evento neurovascolare complesso che si basa sulla vasodilatazione dei tessuti erettili a causa di ossido nitrico derivato neuronale ed endoteliale (NO) rilasciato dall’attivazione dei nervi parasimpatici sulla stimolazione sessuale del rivestimento endoteliale cavernoso 1.

Questo stimolo sessuale provoca il flusso di sangue nel corpo cavernoso e la conseguente rigidità del pene viene mantenuta per mezzo di un meccanismo veno-occlusivo.

Ciò è reso possibile dalla particolare micro-architettura del corpo cavernoso, che consente un sofisticato sistema emodinamico.

Altrimenti, la tunica albuginea svolge un ruolo chiave nella funzione erettile.

Essendo ricco di fibre elastiche è in grado di resistere al sovraccarico del corpo a livelli elevati di pressione intracavernosa, comprimendo le vene effluenti trans-albugineali, oltre a fornire una struttura protettiva inestensibile alle arteriole e ai nervi intracavernosi.

Questa funzione è possibile grazie alla sua struttura fatta di fibre collageniche collegate da ponti di fibre elastiche 2,3

Pertanto, è molto importante mantenere la sua integrità per mantenere il suo ruolo fondamentale nel meccanismo erettile.

La presenza di disturbi strutturali come un’eccessiva deposizione di collagene dà luogo alla formazione di una placca, prima fibrotica e poi calcificata, come si può riscontrare nella malattia di Peyronie.

Inoltre, vi è una significativa diminuzione della concentrazione di fibre elastiche anche in questi pazienti affetti da indurimento pene plastica 4.

Cambiamenti simili sono stati trovati in pazienti sottoposti a prostatectomia radicale, dove le fibre elastiche trabecolari e le fibre muscolari lisce sono diminuite e il contenuto di collagene è stato significativamente aumentato 5.

Con l’avanzare dell’età gli ormoni steroidei gonadici, e in particolare la produzione di testosterone diminuisce 6, la conduzione nervosa rallenta e l’efficienza della microcircolazione vascolare del pene è ridotta.

Gli androgeni sono essenziali per lo sviluppo, la crescita e la maturazione dei tessuti erettili, agendo sull’emostatide nei corpi cavernosi, regolando la crescita della muscolatura liscia e la sintesi proteica dei tessuti connettivi.

Pertanto, una diminuzione della loro produzione potrebbe dar luogo al passaggio dalle fibre elastiche alle fibre di collagene, che è alla base della fibrosi cavernosa 7,8.

Studi recenti hanno dimostrato che il testosterone regola anche l’espressione della fosfodiesterasi di tipo 5 (PDE5) 9.

È noto che la disfunzione erettile (DE) colpisce 150 milioni di persone in tutto il mondo.

Fino a pochi anni fa, si pensava che il 90% di ED avesse un’eziologia psicogenetica.

Inoltre, ulteriori studi neurofisiologici, emodinamici e farmacologici ci hanno aiutato a comprendere meglio il complesso meccanismo biochimico e micro-anatomico della funzione erettile, mostrandoci che il 50% della DE ha un’eziologia organica 10.

D’altra parte, anche l’ED psicogenetico potrebbe essere la conseguenza di un aumento della stimolazione adrenergica e di avere essa stessa un’origine organica 11.

Gli ultimi 20 anni hanno assistito a notevoli cambiamenti nel trattamento della disfunzione erettile.

la nascita e Il successo di inibitori della PDE5 come efficace terapia per la disfunzione erettile è notevole, considerando l’intento che sta dietro lo sviluppo di originale composto: inizialmente progettato come un antianginal agente, è diventato subito evidente che il primo inibitore della PDE5 sul mercato, il sildenafil, visualizzato erectogenesis come effetto collaterale, e il farmaco è stato subito riconosciuto come un potenziale rivoluzionario trattamento per ED.

Inoltre, il sildenafil ha dimostrato di prevenire la progressione della fibrosi del corpo cavernoso nei pazienti prostatectomizzati. La sua efficacia sembra derivare da un effetto anti-proliferativo esercitato sui fibroblasti 12.

È noto che gli inibitori della PDE-5 hanno rivoluzionato il trattamento della disfunzione erettile e cambiato la vita di milioni di persone in tutto il mondo.

Tuttavia c’è ancora un’alta percentuale di pazienti con ED che sono anche affetti da disfunzione endoteliale (56%) e successivamente non rispondono a questa classe di farmaci 13.

Sebbene già ampiamente studiato, NESSUN donatore continua ad essere un argomento importante per quanto riguarda la disfunzione erettile.

Sono stati condotti molti studi per trovare nuovi donatori NO o nuovi attivatori di guanilil ciclasi per cercare di trovare nuovi farmaci per il trattamento di questi pazienti che non rispondono agli inibitori della PDE-5 14.

Il presente lavoro ci mostra un modello per la raccolta di tessuti di corpi cavernosi umani e per fare esperimenti di rilassamento della muscolatura liscia in vivo.

I corpi cavernosi sani prelevati da giovani donatori di cadaveri uccisi da traumi o ictus offrono tessuti in buone condizioni.

In letteratura, non abbiamo trovato un approccio simile a causa della difficoltà di ottenere campioni di tessuti umani.

Con questa tecnica è possibile testare nuovi farmaci, come NESSUN donatore, attivatori di guanilil ciclasi e inibitori della RohA-chinasi sui tessuti muscolari lisci umani in vivo piuttosto che utilizzando corpi cavernosi in vivo da animali come ratti o conigli come è stato eseguito da Pen Wang et al. 15.

Infine, questa tecnica di raccolta e il modello di contrazione-rilassamento della muscolatura liscia potrebbero essere uno strumento molto utile per aiutarci a trovare nuovi farmaci per il trattamento della disfunzione erettile.

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