Minerale osseo: nuove intuizioni sulla sua composizione chimica
Identificazione di ioni HPO4 2 nel minerale osseo
La risonanza magnetica nucleare diretta allo stato solido (ssNMR) non è possibile rilevare i protoni localizzati nel minerale osseo da un campione di tessuto osseo intatto. Ciò è dovuto alla presenza della matrice organica extracellulare i cui diversi segnali dominano lo spettro 1H single pulse (SP) ssNMR di un campione di tessuto osseo54. Tuttavia, la possibilità di rivelare prossimità spaziali su scala atomica tra nuclei di idrogeno e fosforo nell’esperimento ssNMR bidimensionale (2D) {1H}31P Heteronuclear Correlation (HetCor) consente di sondare gli ambienti di idrogeno minerale osseo attraverso l’analisi della dimensione F1 (Fig. 1 BIS). Sfortunatamente, questo esperimento richiede molto tempo e dà origine a una proiezione 1H della dimensione verticale (F1) con un rapporto segnale-rumore relativamente scarso (S/N) e una bassa risoluzione digitale (Fig. 1 TER). Per superare queste limitazioni, abbiamo usato l’esperimento SSNMR a doppia polarizzazione incrociata (CP) unidimensionale (1D) {1H-31P}1H. Consiste in un doppio trasferimento CP condotto in modo “là e indietro” (1H→31P→1H) (Fig. S1). In primo luogo, questo esperimento ci ha permesso di ottenere spettri ssNMR 1H filtrati 31P di minerale osseo da un campione di tessuto osseo di pecora intatto e corticale di 2 anni con un eccellente S / N nonostante un tempo di acquisizione relativamente breve (cioè 9 ore) (Fig. 1 QUATER, D). I diversi ambienti chimici 1H di bone mineral sono ora facilmente osservabili e possono essere analizzati in modo sicuro con precisione. Per quanto riguarda il nucleo cristallino interno delle particelle minerali ossee, gli ioni idrossile presenti nel reticolo cristallino dell’idrossiapatite sono osservati sotto forma di una risonanza complessa centrata a δ(1H) = 0,0 ppm. Per quanto riguarda il loro strato superficiale amorfo, le molecole d’acqua strutturali e le specie di fosfato acido presenti in ambienti non apatici sono osservabili sotto forma di una singola risonanza centrata a δ(1H) = 5.2 ppm e un’ampia risonanza che va da δ(1H) = 7 a 17 ppm32, rispettivamente.
Rilevamento di specie portanti idrogeno nel minerale osseo. 1H-31P cross polarization (CP) based magic angle spinning (MAS) a risonanza magnetica nucleare a stato solido (ssNMR) spettri di un campione di tessuto osseo di pecora secco di 2 anni. (A) spettro di correlazione eteronucleare (HetCor) bidimensionale (2D) {1H}31P (tempo di contatto, tCP = 1000 µs). L’intensità del segnale aumenta dal blu al rosso. B) Proiezione 1H della dimensione verticale (F1) dello spettro 2D {1H}31P HetCor mostrato in (A). {1H-31P}1H doppio CP MAS spettri registrati con i seguenti tempi di contatto: (C) tCP1 = tCP2 = 1000 µs; e, (D) tCP1 = tCP2 = 15000 µs. Il tempo sperimentale totale era lo stesso in ogni esperimento (cioè, 9 ore).
In secondo luogo, questo esperimento consente l’indagine delle dinamiche CP rilevate 1H per rivelare selettivamente la natura dei nuclei 1H vicini ai nuclei 31P. A tal fine, il tempo di contatto 1 (tCP1) è stato mantenuto fisso a 1000 µs, mentre il tempo di contatto 2 (tCP2) è stato variato da 75 µs fino a 1000 µs (Fig. 2). Un aumento uniforme della magnetizzazione è osservato per entrambe le risonanze centrate a δ ( 1H) = 0.0 e δ(1H) = 5.2 ppm (vedi le linee tratteggiate nere), precedentemente attribuite agli ioni OH e alle molecole strutturali H2O secondo il loro rispettivo spostamento chimico 1H NMR. Al contrario, l’evoluzione del segnale ampio nell’intervallo di δ(1H) = 7-17 ppm mostra inizialmente un rapido aumento della sua magnetizzazione (fino a tCP2 = 300 µs) ed è seguita dalla presenza di un comportamento oscillatorio (fino a tCP2 = 1250 µs – vedi la linea tratteggiata nera). Questo comportamento oscillatorio è caratteristico delle oscillazioni dipolari 1H-31P (DP-H) 55,56. Il montaggio dei corrispondenti spettri {1H-31P}1H ssNMR a vari tCP2 non è semplice a causa della sovrapposizione di varie risonanze. Considerando che i campioni di HA sintetici di solito presentano una risonanza OH simmetrica32; mostriamo qui che la risonanza OH del minerale osseo è particolarmente complessa e può essere montata come segue: un picco principale a δ (1H) = 0.0 ppm circondato da due picchi di spalle a δ (1H) = -0.7 e 0.9 ppm (Fig. S3). La risonanza strutturale residua dell’acqua può essere adeguatamente equipaggiata con un singolo picco centrato a δ (1H) = 5,2 ppm (Fig. S4). Al contrario, l’ampio segnale delle specie di fosfati acidi osservabili nell’intervallo δ (1H) = 7-17 ppm non può essere adattato in modo soddisfacente con un singolo picco con posizione fissa e larghezza della linea, specialmente a tempi di contatto brevi (vedere i migliori risultati di adattamento per i vari valori tCP2 in Fig. S4-colonna sinistra). Tuttavia, i risultati di montaggio sono accurati quando vengono utilizzati due picchi diversi con posizioni fisse e larghezze di linea fisse (6,2 ± 0,1 e 5,0 ± 0,1 ppm, rispettivamente) (Fig. S4-colonna destra). Non possiamo affermare che questo segnale ampio sia composto solo da due picchi corrispondenti a due distinti ambienti protonici, ma è probabilmente composto da un’ampia distribuzione di ambienti chimici che porta a una distribuzione di spostamenti chimici NMR. Di conseguenza, Fig. 3A mostra i quattro picchi che sono stati utilizzati per analizzare gli spettri ssNMR 1H filtrati da 31P del minerale osseo per ogni valore tCP2: (i) un picco composito centrato a δ(1H) = 0.0 (viola) e un singolo picco centrato a δ (1H) = 5.2 (grigio) ppm entrambi caratterizzati da una crescita relativamente lenta e uniforme delle loro magnetizzazioni; e(ii) due picchi a δ (1H) = 9.8 (blu) e 14.0 (verde) ppm entrambi visualizzando oscillazioni dipolari (Fig. 3 TER). Per quanto riguarda questi ultimi due picchi, la corrispondenza precisa del profilo Hartmann-Hahn (H-H) (Fig. S2) consente la modellazione numerica delle curve di accumulo CP secondo il modello a coppia di spin singola che tiene conto delle oscillazioni dipolari derivanti dal trasferimento di polarizzazione coerente e dall’impatto della diffusione di spin 1h57:
Quantificazione degli ioni HPO4 2 nel minerale osseo
È stata effettuata la quantificazione degli ioni HPO42 presenti nel minerale osseo. A tal fine, la lineshape e linewidth dei singoli segnali NMR 31P dell’OH− e PO43 containing contenente nucleo cristallino interno e l’H2O e HPO42 containing contenente ambienti non apatitici (strato superficiale amorfo) che sono stati rivelati in Fig. 4B, sono stati utilizzati nel montaggio dello spettro quantitativo 31P single pulse (SP) MAS ssNMR di un campione di tessuto osseo di pecora fresco di 2 anni (Fig. 5 BIS). La percentuale molare di ioni HPO42 e PO43 nel minerale osseo è risultata essere di circa 50/50 ± 5%. Come suggerito dalle nostre osservazioni nei fichi S9 e S10, questo calcolo è stato fatto supponendo che la proporzione molare di ioni HPO42 nel nucleo cristallino interno delle particelle fosse vicina allo 0%. Una proporzione molare così elevata di ioni HPO42 presenti nello strato superficiale amorfo riflette le piccole dimensioni delle particelle minerali ossee: thickness 1-5 nm di spessore, width 10-40 nm di larghezza e length 20-100 nm di lunghezza1, 61,62,63. Poiché abbiamo dimostrato che gli ioni HPO42 sono concentrati all’interno dello strato superficiale amorfo, ora possiamo stimare lo spessore medio di questo strato per un campione di tessuto osseo di pecora di 2 anni. Qui consideriamo una piastrina nanosizzata con uno spessore di 4,0 nm e assumiamo che le densità degli atomi di fosfato presenti nel reticolo cristallino dell’idrossiapatite e nello strato superficiale amorfo siano equivalenti. In tale scenario, lo spessore del nucleo cristallino interno è di circa 2,4 nm (cioè, che è circa il doppio della dimensione della cella unitaria esagonale di idrossiapatite64 lungo gli assi cristallografici a e b; a = b = 0,94 nm); mentre lo spessore dello strato superficiale amorfo esterno può essere stimato essere di circa 0,8 nm (cioè, che corrisponde quindi alla dimensione della cella unitaria esagonale di idrossiapatite lungo a e b, e, quindi, è equivalente all’impilamento di soli due ioni fosfato). Si dovrebbe essere consapevoli che questi sono valori medi che corrispondono alla somma dei contributi di tutti gli ioni fosfato inorganici presenti nel nostro campione di tessuto osseo di pecora di 2 anni. Questi risultati potrebbero essere diversi per i campioni più vecchi in cui la proporzione degli ambienti non apatitici potrebbe essere meno65 a causa della maturazione minerale ossea: la progressiva trasformazione dello strato superficiale amorfo in ambienti apatitici15. Tuttavia, lo spessore dello strato superficiale qui determinato (0,8 nm) è in buon accordo con le dimensioni stimate proposte in alcuni studi precedenti: circa la dimensione di un’unità di fosfato nei mesocristalli di fluorapatite-gelatina66; e circa 1-2 nm nelle idrossiapatiti sintetiche32,67,68.
Quantificazione degli ioni HPO42 e CO32 presenti nel minerale osseo. (A) Quantitative 31P singolo impulso (SP) magic angle spinning (MAS) solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spettro di un campione di tessuto osseo di pecora fresco di 2 anni (linea blu) e il suo corrispondente raccordo (linea tratteggiata rossa) con due picchi. Quei due picchi, la cui forma e larghezza della linea sono stati rivelati in Fig. 4B, corrispondono al nucleo cristallino interno contenente PO43 containing sotto forma di idrossiapatite (picco arancione) e al HPO42–contenente ambienti non apatici sotto forma di uno strato superficiale amorfo (picco viola). B) Spettro infrarosso della trasformata di Fourier (FT-IR) della modalità di vibrazione ν2(CO3) per un campione di tessuto osseo ovino di 2 anni (linea blu) e il relativo raccordo corrispondente (linea tratteggiata rossa). Gli ioni CO32 di tipo B occupano i siti PO43 all’interno del reticolo cristallino dell’idrossiapatite; gli ioni CO32 di tipo A occupano i siti OH all’interno del reticolo cristallino dell’idrossiapatite; mentre CO32 non apatitico – sono presenti all’interno dello strato superficiale amorfo che ricopre le particelle minerali ossee.
Aggiornamento sulla composizione chimica minerale ossea
I risultati presentati qui e altrove 45 suggeriscono che la composizione chimica media del minerale osseo corticale maturo proposto da Legros et al.27, Ca8.3□1,7(PO4)4.3(HPO4 o CO3)1.7 (OH o ½ CO3)0,3□1.7, deve essere riconsiderato. Infatti, questa formula non solo ignora la presenza dello strato superficiale amorfo la cui composizione chimica varia notevolmente rispetto agli ambienti apatitici presenti nel nucleo cristallino interno delle particelle, ma sottovaluta anche la proporzione molare di ioni HPO42. Per proporre una formula aggiornata del nostro campione di tessuto osseo di pecora di 2 anni, abbiamo dovuto innanzitutto determinare la percentuale di peso degli ioni CO32. Un valore del 4,8% con un contributo importante nei carbonati di tipo B è stato trovato attraverso le analisi FT-ir49 (Fig. 5B), che è conforme ai valori rilevati per altri campioni di minerali ossei3. In aggiunta, i seguenti parametri sono stati considerati: (i) le particelle devono rimanere elettricamente neutro (sia interna core cristallino e amorfo strato superficiale); (ii) la proporzione molare di HPO42− ioni relativa all’importo complessivo di ioni fosfato inorganico è vincolata vicino al 50% secondo il presente studio; (iii) il grado di carbonatazione dovrebbe essere vicino al valore sperimentale (4.8% w/w); (iv) la complessiva Ca/(P + C) rapporto molare dovrebbe rimanere accettabile per un campione di tessuto osseo, io.e. nell’intervallo 1,2–1,53 e, infine, (v) la proporzione di ioni carbonati di tipo A, di tipo B e non apatici presenti nello strato superficiale amorfo dovrebbe rimanere in conformità con i dati FT-IR. Una volta che tutti questi vincoli sono stati amalgamati, la composizione chimica media del minerale osseo corticale maturo dal nostro campione di tessuto osseo di pecora di 2 anni può essere approssimata come segue: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. Si dovrebbe notare che questa composizione chimica media corrisponde esclusivamente al nostro campione di tessuto osseo specifico in base ai nostri risultati sperimentali. Quindi questa formula non è universale poiché la variabilità si verifica tra gli esemplari ossei a seconda, in particolare, della specie, dell’età, dell’alimentazione e del loro grado di maturazione.