Sperimentale di progettazione e studio del sistema

Nel 2012, 300 semi di veloce in bicicletta Brassica rapa piante (Wisconsin Veloce Impianti Standard Seme, con alta variabilità genetica) sono stati ottenuti da Carolina Biologici, materiali di consumo, e cresciuto in un phytotron sotto standardizzate suolo, di luce e di irrigazione condizioni. Queste piante sono completamente affioranti (auto incompatibili) e ospitano una variazione genetica sufficiente per rispondere prontamente alla selezione58,59. Da queste piante 300, sono state generate 108 famiglie di semi sib completi da incroci artificiali (sono state utilizzate solo famiglie di semi da incroci in cui entrambi i genitori producevano frutti). Queste 108 famiglie complete di semi sib sono state utilizzate come popolazione di partenza per l’esperimento.

Per la prima generazione dell’esperimento, sono stati stabiliti tre gruppi di trattamento utilizzando le 108 famiglie in modo che ogni famiglia fosse rappresentata in ogni trattamento per controllare il genotipo tra i trattamenti (Fig. 1). Ogni trattamento consisteva quindi di 108 piante (rappresentanti 108 famiglie di semi), che abbiamo suddiviso in tre repliche (A,B, C) contenenti ciascuna 36 piante. Le repliche all’interno dei trattamenti sono state mantenute come linee isolate durante le generazioni 9 (non sono stati effettuati incroci tra le repliche) per essere in grado di valutare cambiamenti evolutivi indipendenti e ripetibili. Le piante di tutte le repliche in tutti i trattamenti sono state coltivate nel phytotron sotto terreno standardizzato (Einheitserde classic), luce (24 h luce) e condizioni di irrigazione. Tutte le piante sono state fenotipizzate ogni seconda generazione a partire dalla generazione 1. I dati del profumo floreale delle generazioni 1 e 3 sono stati persi a causa di problemi tecnici; invece, il profumo è stato raccolto dalla generazione 4. I dati del profumo floreale della generazione 1 sono stati ottenuti dopo la fine dell’esperimento ricrescendo le piante dalla generazione iniziale e raccogliendo il profumo da una pianta da ciascuna delle 108 famiglie di semi. Pertanto, dalla prima generazione in totale 108 piante (36 da ciascuna replica) sono state campionate per il profumo floreale contemporaneamente alle piante della generazione 9.

Evoluzione sperimentale e trattamenti di impollinazione

Nel nostro studio abbiamo utilizzato tre trattamenti di impollinazione: bombi (‘BB’, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Svizzera), hoverflies (‘HF’, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Germania) e impollinazione manuale. Entrambi gli insetti visitano facilmente i fiori di molte specie di Brassicaceae in natura, ma rappresentano diverse categorie di impollinatori funzionali e hanno dimostrato di variare in abbondanza negli habitat naturali46. L’uso di singole specie di impollinatori imita gli ambienti di impollinatori in cui gli impollinatori più abbondanti sono funzionalmente diversi. Nel trattamento di controllo (“CO”), le piante scelte a caso sono state impollinate a mano.

L’impollinazione è stata eseguita 23 giorni dopo la semina in una gabbia di volo (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) nella serra in condizioni di luce standardizzate con bombi e hoverflies. Gli esperimenti sono stati eseguiti tra 0900 ore e 1.500 ore. I bombi erano tenuti in una gabbia di volo separata nella serra. Hoverflies sono stati acquistati come pupe e allevati fino alla schiusa dopo di che le mosche maschi e femmine sono stati separati. Gli impollinatori sono stati autorizzati a foraggiare su piante B. rapa a ciclo veloce (piante del gruppo di controllo della rispettiva generazione) e alimentati con polline aggiuntivo fino a 3 giorni prima del trattamento di impollinazione; successivamente, sono stati forniti solo polline e soluzione zuccherina; 16 h. prima dell’impollinazione, gli impollinatori erano affamati.

Per l’impollinazione, tutte le piante di una replica sono state posizionate casualmente in un quadrato di piante 6 × 6 con una distanza di 20 cm l’una dall’altra nella gabbia di volo. Cinque impollinatori sono stati aggiunti singolarmente e in sequenza e ogni insetto è stato permesso di visitare un massimo di tre piante diverse e poi rimosso dalla gabbia; ogni insetto è stato utilizzato una sola volta. In totale, 12-15 piante per replica hanno ricevuto una o più visite da parte degli impollinatori. La media complessiva (±s.d.) del numero di visite (nelle piante visitate) è stata di 1,35±0,63 per le piante impollinate dal calabrone e di 1,28±0,53 per le piante impollinate da hoverfly. Per le piante che sono state visitate, sono stati registrati il numero di visite e il numero di fiori visitati. Nel gruppo di controllo, 12 piante sono state scelte a caso per replicare e 5 fiori di ogni pianta sono stati impollinati a mano da una pianta padre scelta a caso; i padri sono stati scelti tra le stesse 12 piante. Ogni pianta potrebbe essere donatore di polline a più di una pianta, ma solo ricevuto polline da una pianta. Dopo l’impollinazione, i fiori visitati sono stati contrassegnati e le piante sono state tenute in una gabbia per ulteriori 30 giorni fino a quando i frutti sono stati raccolti. Le sementi sono state contate e il relativo set di sementi è stato calcolato per ogni pianta dividendo il set di sementi individuale per il set di sementi medio nella replica. Inoltre, il numero di semi per frutto è stato calcolato per ogni pianta visitata. Per ogni pianta l’idoneità maschile è stata stimata come paternità prevista (numero di eventi di esportazione di polline).

Da tutti i semi prodotti dai fiori impollinati, un sottoinsieme di semi rappresentativi della produzione di semi di ogni individuo è stato utilizzato per coltivare la prossima generazione. Più semi produceva una pianta, più semi contribuiva alla generazione successiva, che consisteva ancora in 36 piante per ogni replica. Il contributo del seme di ogni pianta visitata nella generazione successiva è stato calcolato per ogni replica come: 36 / (replicare somma di semi / set di semi individuale). I valori inferiori a 0,5 sono stati arrotondati a 1.

Inbreeding depression

Inbreeding depression durante l’esperimento è stata quantificata misurando il peso del seme e il tasso di germinazione, quest’ultimo come percentuale di semi germinati per replica. Per il controllo di tratti di modifiche a causa di depressione da inbreeding, semi prodotti dalle piante di 9a generazione sono state coltivate (che rappresentano il 10 ° generazione) e manualmente incrociate tra di replica entro i trattamenti, in modo che le piante di ciascuna parcella sono stati polline donatore e polline destinatario per le piante di due diverse repliche (♀Un-♂C, ♀B-♂Una, ♀C-♂B). Gli incroci all’interno di queste combinazioni di repliche erano casuali. Dei semi risultanti (l’undicesima generazione) è stato coltivato un individuo per famiglia di semi (36 piante per replica) nelle stesse condizioni dell’esperimento. Di questi incroci inter-replicati, i tratti sono stati nuovamente misurati e utilizzati per il confronto finale dei tratti tra i gruppi di trattamento.

Tratti vegetali

La maggior parte dei tratti, compreso il profumo floreale, sono stati misurati prima dell’impollinazione, 19-21 giorni dopo la semina. Larghezza del petalo, lunghezza, lunghezza del pistillo e diametro del fiore di tre fiori scelti a caso per pianta sono stati misurati con un calibro elettronico (Calibro digitale 0-150 mm,TOOLCRAFT). Nettare da tre fiori è stato raccolto con 1 µl micro tubi capillari (Blaubrand, Wertheim, Germania) e il volume determinato misurando la lunghezza della colonna nettare nella micropipetta con una pinza. Per la quantificazione, è stata utilizzata la media di tre fiori. Per 157 piante equamente suddivise tra i trattamenti, il contenuto zuccherino del nettare è stato determinato utilizzando la derivatizzazione e l’analisi gascromatografica. Per fare ciò, il nettare è stato trasmesso alla carta da filtro conservata in gel di silice. Il settore della carta da filtro contenente il nettare è stato tagliato dal resto della carta da filtro e il nettare è stato eluito in 1 ml di acqua Mili-Q ad alta purezza agitando la diluizione per 90 min con 400 giri / min a 60 °C su uno shaker da laboratorio. Successivamente 50 µl della soluzione sono stati essiccati a 60 °C e derivatizzati con 100 µl di una miscela di piridina anidra (Fisher Scientific, Geel, Belgio), esametilsilazano (Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera) e trimetilclorosilano (Sigma-Aldrich, Buchs, Svizzera) (10:5:3). Successivamente, i campioni sono stati eseguiti da GC-MS come descritto in ref. 32. Abbiamo calcolato le quantità totali di zucchero per fiore e infiorescenza come la somma di tutti i diversi zuccheri (fruttosio, glucosio, saccarosio e sorbitolo). La correlazione tra il contenuto di zucchero del nettare e il volume del nettare è stata positiva e alta (r156=0,732, P<0,001), quindi, per le piante rimanenti, è stato determinato solo il volume del nettare. La raccolta di profumi floreali è stata fatta prima dei saggi biologici in modo non distruttivo da tutte le infiorescenze delle piante non appena almeno cinque fiori erano aperti. Abbiamo usato l’assorbimento dello spazio di testa con un sistema push-pull59, 60. Le infiorescenze delle piante erano racchiuse in cilindri di vetro precedentemente rivestiti con sigmacote (Sigma-Aldrich) e chiusi con una piastra di Teflon. Il numero di fiori aperti è stato contato per ogni pianta. L’aria proveniente dall’ambiente circostante è stata spinta con una portata di 100 ml min−1 attraverso filtri a carbone attivo nel cilindro di vetro. Contemporaneamente, l’aria è stata estratta dal cilindro di vetro con una portata di 150 ml min−1 attraverso un tubo di vetro riempito con Ten 30 mg Tenax TA (60/80 mesh; Supleco, Bellefonte, PA, USA). L’aria dai cilindri di vetro vuoti è stata raccolta come controlli dell’aria. I volatili floreali sono stati raccolti per due ore in un fitotrone in condizioni di luce e temperatura standardizzate. La quantificazione dei volatili è stata condotta mediante gascromatografia con rilevamento selettivo di massa (GC–MSD). I campioni sono stati iniettati in un GC (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) da un campionatore multiuso (MPS; Gerstel, Müllheim, Germania) utilizzando un’unità di desorbimento termico Gerstel (TDU; Gerstel) con un sistema di iniezione a freddo (CIS; Gerstel). Per il termodesorbimento, il TDU è stato riscaldato da 30 a 240 °C ad una velocità di 60 °C min−1 e tenuto a una temperatura finale per 1 min. Il CIS è stato impostato a -150 °C durante la cattura di composti eluenti dal TDU. Per l’iniezione, il CIS è stato riscaldato a 250 ° C ad una velocità di 12 °C s-1 e la temperatura finale è stata mantenuta per 3 min. Il GC era dotato di una colonna HP-5 (diametro 0,25 mm, spessore del film 0,25 µm, lunghezza 15 m) e l’elio era usato come gas vettore ad una portata di 2 ml min−1. L’identificazione e la quantificazione dei composti sono state effettuate seguente60 con il programma Agilent MSD ChemStation. La quantificazione dei composti è stata ottenuta attraverso la misurazione delle aree di picco di ioni bersaglio selezionati specifici per i singoli composti del profumo. Gli ioni bersaglio specifici sono stati ottenuti da standard sintetici di tutti i composti; le aree di picco sono state convertite in quantità assolute utilizzando curve di calibrazione precedentemente ottenute per ciascun composto utilizzando composti sintetici in tre diverse concentrazioni. Nell’analisi sono stati inclusi solo composti profumati presenti in quantità significativamente più elevate rispetto al controllo dell’aria (in totale 14 composti profumati). Tutte le quantità di sostanze volatili sono state calcolate in pg per fiore l-1 aria campionata.

Ventitré giorni dopo la semina, lo stesso giorno in cui è stata effettuata l’impollinazione, sono stati registrati il numero di fiori aperti e l’altezza di ciascuna pianta. Dopo l’impollinazione (ma lo stesso giorno) sono stati registrati gli spettri di riflettanza del colore di tre petali di diversi fiori non impollinati (quando possibile) per pianta utilizzando uno spettrofotometro a fibre ottiche (AvaSpec-2048; Avantes, Apeldoorn, Paesi Bassi) e una sorgente di luce pulsata allo Xeno (AvaLight-XE; Avantes). Un petalo alla volta è stato posto sotto lo spettrofotometro (concentrandosi specificamente sulla parte distale del petalo) e la riflettanza percentuale (relativa a uno standard bianco) tra 200 e 900 nm ogni 0,6 nm è stata registrata in modalità di trasmissione. Dello spettro misurato, solo la media dei valori di riflettanza ogni 10 nm da 260 a 650 nm dai tre petali è stata utilizzata nell’analisi. Nelle piante dell’undicesima generazione, è stato analizzato un sottoinsieme di circa 20 piante per replica per il colore, poiché nessuno dei PC di colore è risultato essere in fase di selezione durante l’esperimento. L’area della superficie del petalo assorbente e riflettente ultravioletto è stata misurata solo in impianto di generazione 11 con una fotocamera digitale sensibile ai raggi ultravioletti con lente al quarzo. Sono state scattate foto di fiori e quantificata l’area di assorbimento ultravioletto utilizzando il pacchetto software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Test di preferenza dell’impollinatore

Sono stati condotti test per le preferenze dell’impollinatore per ciascuna replica con entrambi i tipi di impollinatori. Per ciascuna replica sono stati eseguiti due test comportamentali (uno per ciascun trattamento impollinatore). Le piante impollinate da bumblebee e hoverfly (generazione 11) di ciascuna replica sono state accoppiate casualmente e posizionate fianco a fianco (distanza ca 30 cm) in una gabbia di volo (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m). Un impollinatore è stato posto nella gabbia e ha permesso di visitare una pianta. Gli impollinatori sono stati immediatamente catturati dopo aver fatto la loro scelta. Ogni pianta-coppia è stato analizzato con un impollinatore.

Auto-compatibilità e selfing autonomo

Per testare l’auto-compatibilità, abbiamo coltivato piante dalla prima (15 piante per replicare) e dall’undicesima generazione (30 piante per replicare). Un seme per famiglia del seme (dalle famiglie scelte a caso) è stato coltivato e due fiori per pianta selfed ad anthesis. Il numero medio di semi prodotti per fiore selfed per ogni singola pianta è stato utilizzato come misura di auto-compatibilità.

Per testare il selfing autonomo, abbiamo coltivato circa 12 piante (un seme per famiglia) per replica da ogni trattamento di generazione 11 e 1 (in totale 162 piante). Dopo 30 giorni in cui ca 20 fiori erano aperti, i germogli rimanenti in ogni pianta sono stati accuratamente tagliati e il numero di fiori aperti è stato registrato. Alla pianta è stato quindi permesso di sviluppare frutti senza che nessun insetto accedesse alle piante. Dopo la maturazione dei frutti, i semi sono stati raccolti e il numero di semi è stato contato e pesato per ogni pianta. Il numero di frutti per fiore aperto e seme per frutti sono stati utilizzati come misura per selfing autonomo. Poiché alcune piante avevano un numero molto alto di frutti per fiori aperti, abbiamo eliminato questi valori anomali per il confronto finale di selfing autonomo. Il seguente numero di valori anomali è stato soppresso: 1 nella generazione 1; in G11: 2 in BB, 3 in HF, 2 in CO.

Analisi statistica

Per analizzare la selezione fenotipica, i differenziali di selezione e i gradienti sono stati calcolati facendo regredire l’idoneità delle piante sui tratti61. Questa analisi è stata fatta separatamente per i trattamenti, ma per tutte le repliche e le generazioni combinate. Come stima dell’idoneità, è stato utilizzato il “numero di visite”, che era una variabile di conteggio e seguiva una distribuzione di Poisson. Un’altra variabile di fitness, “set di semi relativi” ha avuto una distibution polarizzata dai molti valori zero; inoltre, set di semi ha mancato l’unico componente di fitness maschile della prima pianta visitata, che non ha impostato il seme da questa visita (perché gli impollinatori inizialmente non portavano polline di Brassica). Il numero di visite è stato, tuttavia, fortemente correlato con il relativo seed set (BB: r626=0.694, P<0.001; HF: r605=0.597, P<0.001). Modelli lineari generalizzati (con distribuzione di Poisson) sono stati utilizzati per calcolare gradienti di selezione (multivariati) e differenziali (univariati) per ogni trattamento con numero di visite come variabile dipendente e tratti come covariate. Inoltre, i gradienti di selezione quadratica sono stati calcolati con tutti i tratti e il termine quadrato di ciascun tratto aggiunto al modello, e successivamente i gradienti raddoppiati62. Per verificare le differenze nella selezione tra bombi e hoverflies, è stato eseguito un modello lineare generalizzato (con distribuzione di Poisson) con numero di visite come variabile dipendente, trattamento come fattore fisso, tratti vegetali come covariate e trattamento di interazione*tratto vegetale. Prima dell’analisi di selezione, tutte le variabili erano standardizzate per significare=0 e s.d.=1 (valori Z) a livello di replica. Un modello lineare generalizzato è stato utilizzato anche per confrontare i tassi di visita tra piante impollinate da bombi e hoverfly in tutte le generazioni. I valori dello spettrofotometro a colori floreali sono stati ridotti attraverso l’analisi del componente principale (PC) con rotazione varimax. Nell’analisi sono stati utilizzati solo PC con un autovalore superiore a uno.

Il cambiamento evolutivo nei tratti delle piante è stato valutato in piante dell’11a generazione utilizzando l’analisi della funzione discriminante lineare multivariata e modelli lineari generali univariati (GLM). Per GLM, ogni tratto è stato utilizzato come variabile dipendente, replicare come fattore casuale e trattamento come fattore fisso con test post-hoc LSD. Per discriminare l’impatto della selezione naturale dalla deriva, abbiamo valutato se le differenze tra i tratti fossero coerenti tra le repliche di un determinato trattamento di impollinazione. Nell’analisi GLM, un significativo effetto di “trattamento” indica la differenza tra i diversi gruppi di impollinatori in tutte le repliche e quindi discrimina l’evoluzione specifica dell’impollinatore dalla deriva. La deriva sarebbe indicata da cambiamenti evolutivi solo in alcune repliche (casuali), indicate da un significato nel fattore “replicare” o interazione tra “replicare” e “trattamento”. Anche GLM ha valutato l’autocompatibilità e il selfing autonomo, ma i valori degli impianti di prima generazione sono stati inclusi nell’analisi. Per le analisi dei volatili e del volume del nettare, i dati sono stati trasformati in ln(1+x) per avvicinarsi alla distribuzione normale. Per il GLM con le variabili di colore, è stata eseguita un’analisi PC come descritto sopra, ma senza una preventiva standardizzazione delle variabili. L’analisi PC è stata eseguita per tutti i trattamenti, le repliche e tutte le generazioni insieme, risultando in quattro PC che spiegano il 96,9% della varianza totale. La frequenza dei fiori nectarless è stata analizzata separatamente per ogni generazione, utilizzando modelli lineari generalizzati con distribuzione bimodale, con “presenza di nettare” (sì/no) come variabile dipendente e trattamento e replica come fattori. I tratti nei fiori nettariferi e nettariferi sono stati confrontati insieme per la nona e l’undicesima generazione, utilizzando modelli lineari generali con il tratto come variabile dipendente e la “presenza di nettare” e il trattamento come fattori fissi. Le preferenze di prima scelta di bombi e hoverflies sono state analizzate mediante test binomiale (test-prop=0.5; tutte le repliche raggruppate). Le correlazioni tra nettare e caratteristiche vegetali sono state calcolate per tutte le generazioni combinate usando le correlazioni prodotto-momento di Pearson con valori trasformati da ln. Le statistiche sono state eseguite con IMB SPSS Statistics (Versione 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

Disponibilità dei dati