Cos’è un anticorpo policlonale?
Come fare anticorpi policlonali
Un anticorpo policlonale è una raccolta di manyimmunoglobulins, ciascuno creato da un altro B-clone di cellule. Questi anticorpi mirano a epitopi diversi, o siti di legame, su un singolo antigene. La derivazione da più cloni di cellule B e il successivo targeting di più epitopi è ciò che differenzia gli anticorpi policlonali dagli anticorpi monoclonali.
Come produrre anticorpi policlonali
Tutta la generazione di anticorpi, policlonali o monoclonali, inizia con la stimolazione di una risposta immunitaria, chiamata immunizzazione. Gli obiettivi previsti vengono iniettati nell’ospite, riconosciuti dal sistema immunitario come estranei e mirati dagli anticorpi per il blocco o la clearance immunitaria. Il mancato montaggio di una risposta immunitaria richiederebbe l’uso di adiuvanti, sostanze immunogeniche come adiuvante di Freund o keyhole limpet hemocyanin (KLH), per guidare ulteriormente il reclutamento immunitario. L’immunizzazione comprende la maggior parte di ciò che è necessario per produrre anticorpi policlonali. Una tipica risposta immunitaria è descritta di seguito.
La produzione di anticorpi inizia con l’immunizzazione
Esposizione iniziale per la risposta immunitaria primaria
L’esposizione iniziale dell’ospite all’antigene con adiuvanti appropriati, l’esposizione è definita immunizzazione “Prime”. I metodi tipici di esposizione includono l’iniezione nella pelle, nel peritoneo, nello strato sottocutaneo o nel muscolo. Alternative meno comuni sono la somministrazione orale e intranasale.L’immunizzazione del DNA è anche una tecnologia emergente per antigeni tossici o altrimenti difficili da produrre. Qualsiasi successiva esposizione all’antigene è definita un’immunizzazione “spinta”.
Elaborazione dell’antigene mediante cellule presentanti l’antigene
Macrofagi, cellule dendritiche (DC) e, in misura minore, cellule B, tutte le cellule presentanti l’antigene (APC), interiorizzano l’antigene mediante endocitosi o fagocitosi. L’elaborazione dell’antigene rompe l’antigene in pezzi più piccoli che vengono poi spostati sulla superficie dell’APC.
La stimolazione delle cellule B
Il riconoscimento dell’antigene presentato sulla superficie degli APC induce il rilascio di molecole di segnalazione stimolatoria, citochine, dalle cellule T Helper. Queste citochine attivano le cellule B che hanno anche riconosciuto l’antigene attraverso il loro recettore delle cellule B (BCR). Alcune cellule B non richiedono l’attivazione delle cellule T Helper dopo l’interazione BCR-antigene, di solito producendo una risposta immunitaria più rapida con anticorpi a bassa affinità. Il coinvolgimento delle cellule T Helper è fondamentale in una risposta immunitaria completa così come regulatingself-tolleranza.
Proliferazione delle cellule B e secrezione di anticorpi
Le cellule B attivate si dividono per creare popolazioni di cellule B e plasmacellule di memoria. Entrambi i tipi di cellule riconoscono lo stesso epitopo. Le plasmacellule secernono anticorpi nel siero per il riconoscimento immunitario mentre le cellule B della memoria persistono per periodi più lunghi, fornendo una risposta rapida all’esposizione secondaria dello stesso antigene.
Misurare la risposta immunitaria
Per valutare i progressi è necessario misurare i livelli di anticorpi durante il processo di immunizzazione. AnELISA contro l’antigene bersaglio confronta i campioni di siero immunizzati con campioni di siero pre-immunizzati che rivelano il grado di risposta immunitaria determinata dall’immunizzazione. Le diluizioni seriali dei campioni determinano il titolo dell’anticorpo. Tipicamente un 1:il titolo 64.000 è considerato una risposta immunitaria robusta e sufficiente per procedere alla raccolta del siero o alla fusione linfocitaria. I titoli più bassi possono richiedere successive vaccinazioni di spinta, vie di somministrazione alternative o adiuvanti aggiuntivi.
Raccolta di siero di anticorpi policlonali
La produzione di anticorpi policlonali richiede semplicemente il recupero del sangue dall’animale ospite e la separazione della frazione cellulare dalla frazione sierica contenente anticorpi secreti. Poiché molti anticorpi specifici dell’antigene sono secreti da più cellule B attivate, il siero del sangue contiene i molti prodotti di diversi cloni anticorpali, da qui il termine anticorpo policlonale. In particolare, la creazione di anticorpi clonali multipli contro un antigene si ottiene sia elaborando l’antigene in frammenti sia ciascun frammento con regioni più piccole, definite epitopi. Ciascuno può essere riconosciuto da BCR specifici. Distinte popolazioni di cellule B secernono anticorpi specifici, ma diversi contro lo stesso antigene. Inoltre, il siero contiene non solo anticorpi diretti contro l’antigene target previsto, ma tutte le altre immunoglobuline contro altri bersagli, farmaci, ormoni, ecc. sono nel siero. Il siero può essere utilizzato direttamente come sonda di biologia molecolare, ma spesso richiede un’ulteriore purificazione per aumentare la sensibilità e la specificità di un particolare test. La purificazione di affinità raggiunge il recupero dell’anticorpo ai vari gradi secondo la tecnica come indicato sotto, tuttavia nessuno raggiunge la specificità del livello dell’epitopo di un anticorpo monoclonale.
| Affinity Purification Technique | Pro | Con |
|---|---|---|
| Protein A/G | Simple, Cost effective | Recovers all immunoglobulin. |
| Antigen Specific | Recovers only antigen specific antibody. | Richiede una quantità non banale di antigene. |
Polyclonal Antibody Applications
| Application | Polyclonal AntibodyUse Rationale |
|---|---|
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ELISA Detection Antibody
(direct, indirect, sandwich, and capture ELISA formats) |
Binds multiple epitopes to deliver many detection molecules.
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ELISA Capture Antibody
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Polyreactivity can maximally recover antigen from samples.
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Western Blot
Detection Antibody |
Multiple epitope recognition can allow for antigen changes (denaturing/linearizing).
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Target recognized by many Ab for maximal drug delivery, immune recruitment, blocking, or activation.
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Test clinici
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Potenzialmente maggiore capacità di rilevamento.
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