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A. Introduzione

Il tipico microscopio ottico composto (Fig.1) è in grado di aumentare la nostra capacità di vedere i dettagli di 1000 volte in modo da poter vedere oggetti piccoli come 0,1 micrometri (um) o 100 nanometri (nm). I microscopi elettronici estendono ulteriormente questa gamma permettendoci di vedere oggetti piccoli come 0,5 nm di diametro o circa 1/200. 000 th la dimensione che possiamo vedere ad occhio nudo. Inutile dire che lo sviluppo e l’uso dei microscopi hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione delle cellule e della loro struttura e funzione.

Figura 1. Microscopio composto binoculare.

B. Ingrandimento, risoluzione e distanza di lavoro

L’ingrandimento è semplicemente una funzione di far apparire un oggetto più grande, come quando usiamo una lente manuale per ingrandire la parola stampata. Semplicemente ingrandendo un oggetto senza un aumento simultaneo della quantità di dettagli visti non fornirà allo spettatore una buona immagine. La capacità di un microscopio (o di un occhio) di vedere i dettagli è una funzione del suo potere risolutivo. Il potere risolutivo è definito come la distanza minima tra due oggetti alla quale gli oggetti possono essere distinti come separati ed è una funzione della lunghezza d’onda della luce utilizzata e della qualità dell’ottica. In generale, più breve è la lunghezza d’onda della sorgente luminosa, maggiore è la risoluzione del microscopio.

Distanza di lavoro è la distanza tra la lente dell’obiettivo e il campione. A basso ingrandimento la distanza di lavoro è relativamente lunga. Come si aumenta l’ingrandimento la distanza di lavoro diminuisce drasticamente. Le lenti ad immersione in olio toccano pacificamente il campione. Essere consapevoli di questo cambiamento nella distanza di lavoro con ingrandimento crescente in modo da evitare danni ai vostri campioni.

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C. Parti del microscopio ottico monoculare:

Si prega di prendere tempo per familiarizzare con il microscopio e il suo uso corretto. I controlli delle due marche di microscopi che utilizziamo nei nostri corsi sono mostrati di seguito (Fig. 2).

Figura 2. Controlli sui microscopi binoculari composti Leica e Olympus.

1. Lente oculare o oculare: i nostri sono ingrandimento 10x. Gli ambiti che useremo sono monoculare (un oculare solo.)

2. Tubo del corpo: contiene specchi e prismi che dirigono l’immagine alla lente oculare.

3. Nosepiece: tiene le lenti dell’obiettivo, ruota, nota il positivo si ferma per ogni obiettivo.

4. Lenti obiettivo: di solito 3-4 sui nostri ambiti, 4x, 10x, 43x, 100x immersione in olio (red banding). Ingrandimento totale = potere oculare x potere obiettivo.

5. Stage: piattaforma su cui sono montate le diapositive per la visualizzazione; alcuni ambiti hanno stadi meccanici. Scopri come agganciare correttamente la diapositiva in posizione.

6. Diaframma: il diaframma controlla la quantità di luce che passa al campione e può influenzare drasticamente la messa a fuoco dell’immagine. IMPARA A USARE IL DIAFRAMMA IL PIÙ RAPIDAMENTE POSSIBILE. LA MAGGIOR PARTE DEI PROBLEMI SI AVRÀ MESSA A FUOCO SARÀ A CAUSA DI REGOLAZIONE ERRATA DELLA LUCE.

Abbiamo due tipi:

• diaframma a iride: Cercare una leva appena sotto il palco vicino alla parte anteriore.
• tipo di quadrante: Appena sotto il palco c’è un quadrante rotante con aperture di dimensioni diverse (fori); questo tipo è utile per creare un effetto di campo pseudo scuro.

7. Manopole di messa a fuoco: Situato sul lato del microscopio; più esterno è la messa a fuoco fine e più interno è la messa a fuoco grossolana.
8. Sorgente luminosa: i nostri ambiti hanno costruito in sorgenti luminose. L’interruttore a pulsante si trova (più spesso) dietro l’obiettivo della luce sulla base.

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D. Cura e manipolazione del microscopio composto

Ci sono solo alcune regole assolute da osservare nella cura per i microscopi che si intende utilizzare. Curato, questi strumenti dureranno molti decenni e continueranno a funzionare bene. Si prega di segnalare immediatamente eventuali malfunzionamenti al proprio istruttore.

1. Usa SEMPRE due mani per portare il mirino – una sul braccio e una sotto la base-SENZA ECCEZIONI! NON portare mai l’ambito a testa in giù, per l’oculare può e cadrà fuori.

2. Utilizzare la carta per lenti per pulire tutte le lenti prima di ogni sessione di laboratorio e dopo aver utilizzato la lente ad immersione in olio. NON USARE MAI, NON ORA, NON MAI, ALTRO CHE CARTA PER LENTI PER PULIRE LE LENTI. Altre carte sono troppo impure e graffiano il rivestimento ottico sulle lenti. Inoltre, non utilizzare liquidi durante la pulizia delle lenti-SOLO CARTA PER LENTI!

3. Utilizzare sempre la corretta tecnica di messa a fuoco per evitare di speronare la lente obiettivo in una diapositiva – questo può rompere la lente obiettivo e/o rovinare una diapositiva costoso.

4. Spegnere sempre la luce quando non si utilizza l’ambito.

5. Posizionare sempre con attenzione il filo fuori dal pericolo. Fili in loop negli spazi delle gambe invitano un grande disastro microscopio. Prova a far scorrere il filo verso il basso attraverso le maniglie dei cassetti sul lato del tuo spazio in panchina.

6. Sostituire sempre il coperchio del microscopio quando lo si mette via

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E. Procedura di messa a fuoco: Microscopi monoculari composti

1. Accendi la sorgente luminosa.

2. Passare alla lente obiettivo 10x.

3. Torna sulla messa a fuoco grossolana per sollevare il pezzo del naso.

4. Posizionare il vetrino del campione sul palco e fissarlo nella posizione corretta. Guardate la diapositiva e posizionarlo in modo che il campione è sopra l’apertura della luce nella fase.

5. Obiettivo inferiore al limite inferiore (vicino alla diapositiva). Sollevare l’obiettivo utilizzando la manopola di messa a fuoco grossolana fino a vedere l’immagine messa a fuoco e poi uscire di nuovo, quindi mettere a fuoco di nuovo fino a trovare il centro di messa a fuoco. Regolare la messa a fuoco fine in modo simile.

6. Centrare l’immagine e regolare la luce utilizzando il diaframma.

7. Recenter e regolare la messa a fuoco, prima grossolana, poi messa a fuoco fine come al punto 5.

8. Regolare il diaframma secondo necessità.

9. Ora passare obiettivi al 43x se è necessario un ingrandimento superiore. Regolare messa a fuoco fine e la luce (diaframma), se necessario.

I nostri ambiti sono parfocal il che significa che quando si passa da bassa (100x) ad alta (430x) potenza, un’immagine focalizzata a bassa potenza rimarrà più o meno a fuoco alla potenza superiore. Molto probabilmente dovrai regolare leggermente la messa a fuoco e il diaframma.

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F. Procedura di immersione in olio

Su alcuni dei nostri monoculare, e tutti i microscopi binoculari composti, abbiamo 100x lenti ad immersione in olio. Questi possono essere identificati da una banda rossa intorno all’alloggiamento dell’obiettivo. A ingrandimenti superiori a circa 500x la luce viene rifratta troppo mentre passa attraverso l’aria per produrre un buon potere risolutivo. Così, ottica per questi ingrandimenti superiori sono fatti per utilizzare con un olio minerale di alta qualità come mezzo per la trasmissione della luce. È indispensabile utilizzare solo olio per immersione e pulire accuratamente l’obiettivo con carta per lenti dopo ogni utilizzo.

1. Individuare la regione di interesse sulla diapositiva e centrarla a 430x.

2. Sollevare la lente dell’obiettivo al suo limite (ad es., massimizzi la distanza fra stadio ed obiettivi) e faccia oscillare la lente fuori del modo circa metà strada alla posizione seguente.

3. Posizionare con cautela una piccola goccia di olio per immersione direttamente sul vetrino sopra il centro della regione di interesse.

4. Ruotare l’obiettivo ad immersione in olio in posizione e, con attenzione, guardando di lato, abbassarlo utilizzando la manopola di messa a fuoco grossolana fino a quando l’obiettivo non entra in contatto con la goccia d’olio. Vedrete il salto goccia in una colonna come il contatto è fatto.

5. Abbassare la lente un po ‘ di più e poi, usando la messa a fuoco fine e guardando attraverso la lente oculare, concentrarsi sul campione.

6. Al termine, pulire la lente con carta per lenti fino a quando non si stacca più olio e pulire la diapositiva se deve essere salvata.

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G. Determinazione del diametro del campo visivo

Potresti voler stimare la dimensione dei campioni (ad esempio, le celle) che vedrai in laboratorio. Il modo migliore per farlo è con un micrometro oculare, un inserto oculare di precisione che ha un righello inciso nel vetro. Gli ambiti monoculari che utilizziamo nei corsi introduttivi non sono così attrezzati, quindi useremo un metodo alternativo basato sulla conoscenza del diametro del campo visivo per il tuo particolare microscopio. Per fare ciò, è necessario determinare:

• il diametro approssimativo del campo visivo a basso ingrandimento per il microscopio specifico.
• l’ingrandimento totale per ciascuno dei vostri altri obiettivi.

Sapendo questo per ogni obiettivo, è possibile confrontare le dimensioni del campione con il diametro del campo noto e fare un ragionevole esima di dimensioni. Questa tecnica funziona per qualsiasi microscopio.

1. Ottenere una scala di scorrimento e posizionarlo sul vostro ambito. Un righello metrico trasparente funzionerà pure.

2. Mettilo a fuoco usando l’obiettivo 10x (100x in totale). Le barre di scala sono incrementi di 1mm come mostrato nella figura seguente. Quindi, una barra nera = 0,5 mm come fa uno spazio.

3. Spostare la diapositiva in modo tale che il bordo di una barra nera esterna sia appena tangente al campo illuminato (vedere il punto “A” sopra).

4. Partendo da quel bordo, stima quante barre e spazi sono necessari per attraversare il campo visivo. Probabilmente dovrai stimare l’ultima frazione di uno spazio o una barra. Per la maggior parte dei nostri microscopi è di circa 1,8-2,0 mm di larghezza. È necessario controllare questo su qualsiasi microscopio che si utilizza che non dispone di un micrometro oculare.

5. Registra il numero ID dell’ambito e il diametro del campo a 100x nel tuo notebook da laboratorio per riferimento futuro.

6. Successivamente, calcolare la larghezza del campo a 430x ingrandimento totale utilizzando la seguente formula (ci riferiamo al mag 100x come “bassa potenza” e 430x come “alta potenza”):

(low power mag/ alta potenza mag) x di bassa potenza, diametro del campo (in mm)

Per esempio, si supponga di determinare che il 100x campo un diametro di 1.8 mm, a 430x, il diametro del campo sarebbe:

(100 / 430) x 1,8 mm = 0.418 mm = 418 um (micrometri)

si noti che il diametro del campo ad alta potenza è proporzionale al rapporto tra il basso ad alto potere obiettivi. Cioè, aumentando l’ingrandimento, il campo visivo effettivo diventa proporzionalmente più piccolo.

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H. Microscopi ottici binoculari composti
Parti del microscopio ottico

1. Lente oculare o oculare: i nostri sono ingrandimento 10x. Gli ambiti che useremo sono binoculari (due oculari).

2. Body tube: contiene specchi e prismi che dirigono l’immagine verso le lenti oculari.

3. Nosepiece: tiene le lenti dell’obiettivo, ruota

4. Lenti obiettivo: di solito 3-4 sui nostri ambiti, 4x, 10x, 43x, 100x immersione in olio (red banding). Ingrandimento totale = potere oculare x potere obiettivo. La maggior parte dei nostri binocoli hanno lenti a posizione fissa-il palco si muove su e giù piuttosto che l’obiettivo.

5. Stage: piattaforma mobile su cui sono montate le diapositive per la visualizzazione; tutti i nostri ambiti hanno stadi meccanici con scale a nonio X,Y. Le manopole di messa a fuoco spostano il palco su e giù.

6. Condensatore: Un substage lente che mettere a fuoco la luce sul campione. I nostri binocoli hanno condensatori che si muovono su e giù per focalizzare il fascio di luce.

7. Diaframma a iride: il diaframma si trova appena sotto il palco e controlla la quantità di luce che passa al campione e può influenzare drasticamente la messa a fuoco dell’immagine.

8. Manopole di messa a fuoco: più esterno è la messa a fuoco fine e più interno è la messa a fuoco grossolana. Sul binocolo queste manopole controllano il movimento su/giù del palco.

9. Sorgente luminosa: i nostri ambiti hanno costruito in sorgenti luminose. L’interruttore ON/OFF del reostato si trova sul cannocchiale o sull’alimentatore esterno e viene utilizzato per regolare l’intensità della luce.

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I. Procedura di messa a fuoco: Microscopi binoculari composti

1. Accendi la sorgente luminosa. Gli ambiti Binoc hanno un’unità integrata o un alimentatore esterno.

2. Passare alla lente obiettivo 10x.

3. Regolare la messa a fuoco grossolana per sollevare il nasello (o abbassare il palco).

4. Agganciare il vetrino del campione sul palco nella posizione corretta.

5. Guarda le lenti oculari del tuo mirino. Un obiettivo è fisso e l’altro ha un anello di messa a fuoco (come un binocolo). Portare la lente il più vicino possibile alla diapositiva, quindi, guardando solo attraverso la lente oculare fissa, tornare indietro fino a quando il campione non viene messo a fuoco. Regolare la messa a fuoco fine in modo simile per l’obiettivo fisso.

6. Ora, guardando solo attraverso l’oculare regolabile, regolare la messa a fuoco utilizzando l’anello di messa a fuoco intorno alla lente. Guarda con entrambi gli occhi (regola la distanza interpupillare per vedere un singolo campo illuminato rotondo) e fai delle piccole regolazioni per mettere a fuoco.

7. Centrare l’immagine e regolare la luce utilizzando l’obiettivo del condensatore, il diaframma a iride e il reostato della sorgente luminosa.

8. Recenter e regolare la messa a fuoco, prima grossolana, poi messa a fuoco fine come in 5.

9. Regolare il diaframma secondo necessità.

10.Ora passare obiettivi a una potenza superiore. Regolare messa a fuoco fine e la luce (diaframma), se necessario.

I nostri ambiti sono parfocal il che significa che quando si passa da bassa ad alta potenza, un’immagine focalizzata a bassa potenza rimarrà più o meno a fuoco alla potenza più alta. Molto probabilmente dovrai regolare leggermente la messa a fuoco e il diaframma (aumentare la luce a potenze più elevate.

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Department of Biology, Bates College, Lewiston, ME 04240