Introduzione

Familiare Più Lipomatosi (FML, OMIM% 151,900) è una rara malattia autosomica dominante dell’ipoderma caratterizzata dallo sviluppo di ben incapsulato noduli sottocutanei sul tronco e delle estremità.1 Le prime segnalazioni di tumori adipocitari multipli sono state fatte dal 1846 da Sir Benjamin Brodie.2 Risultati successivi di Blaschko (1891) e Alsberg (1892) hanno dimostrato una recidiva familiare delle lesioni e hanno osservato un aumento dell’incidenza tra i maschi.1,3,4 Negli anni successivi, molti altri autori pubblicarono famiglie con caratteristiche altamente suggestive di FML, 1,5, 6 e infine nel 1970 Das Gupta classificò i tumori lipomatosi in tre categorie: solitari o sporadici, FML e Lipomatosi simmetrica multipla (MSL).7,8

I lipomi solitari sono considerati la neoplasia benigna più comune dei tessuti molli negli adulti, ma i lipomi multipli si verificano nel 5% degli individui.9,10 La prevalenza esatta di FML è sconosciuta, ma è stata stimata essere 0.002%.8,11,12 Età-L’insorgenza dei noduli è compresa tra 30 e 40 anni, raggiungendo il picco massimo negli anni ‘ 50.6,8,13,14 È stato ampiamente affermato che questo disturbo mostra una preferenza per i maschi, tuttavia, un gran numero di lavori dimostrano che entrambi i sessi sono ugualmente colpiti.15-17 Sebbene sia considerata una malattia benigna, in alcuni individui possono comparire preoccupazioni cosmetiche, compromettendo la loro qualità di vita. Inoltre, è anche prevalente negli individui obesi.9

Fino ad ora, la ricerca disponibile in FML è stata esplicitamente focalizzata sugli aspetti clinici e le questioni molecolari di solito non sono studiate. La letteratura suggerisce che almeno il 70% dei lipomi sporadici deriva da riarrangiamenti citogenetici che coinvolgono la banda 12q13-15, il che potrebbe portare a un’espressione deregolamentata del gene HMGA2 (High Mobility Group AT-hook 2). Questo gene codifica le proteine della cromatina dei non istoni responsabili dei cambiamenti conformazionali del DNA, della proliferazione aberrante delle cellule e dello sviluppo dei tumori mesenchimali benigni.18-20

Riconoscere la base molecolare delle condizioni genetiche e l’implementazione di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento ha permesso di esplorare e chiarire altri meccanismi coinvolti nell’eziologia di diverse genodermatosi. Pertanto, questo studio mirava a eseguire una caratterizzazione clinica e molecolare di sette individui con FML per rilevare varianti in sei geni candidati correlati alla lipomatosi utilizzando tecniche di Sanger e next-Generation sequencing (NGS).

Materiali e metodi

Pazienti e aspetti etici

Questa ricerca è stata condotta nel rispetto dei principi della Dichiarazione di Helsinki. L’approvazione è stata ottenuta dall’Institutional Review Board prima dello studio (Il Comitato etico di ricerca presso FCM-UNICAMP, file N° 1.313.164) e tutti i partecipanti hanno dato il consenso informato scritto. Abbiamo condotto lo studio nella clinica ambulatoriale del servizio di genetica medica presso l’Ospedale clinico dell’Università di Campinas (HC-UNICAMP) a São Paulo, in Brasile. Un totale di sette individui appartenenti a cinque famiglie non correlate (denominati dalla A alla E) erano ammissibili. I criteri primari di inclusione per la selezione dei soggetti erano i seguenti: i) età superiore ai 18 anni, ii) diagnosi clinica e istopatologica di lipoma o angiolipoma e iii) recidiva familiare che suggerisce ereditarietà autosomica dominante. I principali aspetti clinici sono stati raccolti dalle cartelle cliniche utilizzando un modulo strutturato. La valutazione fisica ha comportato la partecipazione di specialità dermatologiche e genetiste. Il Dipartimento di Patologia di HC-UNICAMP ha fornito i campioni istopatologici. I risultati clinici sono dettagliati nella Tabella 1.

Tabella 1 Riassunto Clinico dei Pazienti con FML

Sanger Sequenziamento del Gene HMGA2

il DNA Genomico è stato estratto da periferico in EDTA campioni di sangue di sette pazienti secondo il convenzionale fenolo-cloroformio procedura utilizzata da Sambrook et al21

Una reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata effettuata per amplificare cinque esoni e introne-esone giunzioni regioni del HMGA2 gene. Utilizzando due strumenti bioinformatici online, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) e OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), abbiamo progettato la specifica coppia di primer, come riassunto nella Tabella 2.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies®) seguendo le istruzioni del produttore. I cromatogrammi sono stati esaminati utilizzando Chromas v. 2.6. 5. I risultati sono stati confrontati con HMGA2 Ensembl transcript number EN00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Abbiamo controllato le nuove varianti in tre set di dati pubblici: i) La Global Alliance for Genomics and Health (GA4GH) Beacon network (https://beacon-network.org/#/), ii) Il Consorzio di aggregazione Exome (http://exac.broadinstitute.org/) e, iii) Archivio online delle mutazioni brasiliane (http://abraom.ib.usp.br/). Per valutare i punteggi di patogenicità e gli effetti di danno di nuove varianti nel gene HMGA2 candidato, abbiamo usato diversi modelli di previsione silico come VEP (Variant Effect Predictor),22 FATHMM (Analisi funzionale attraverso modelli di Markov nascosti),23 UMD-predictor,24 SIFT (Ordinamento intollerante da tollerante),25 PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer),26 e Mutation Taster.27

Pannello multi-gene target

È stato eseguito un pannello personalizzato per valutare i geni coinvolti nella lipomatosi sindromica. Per eseguire questa tecnica, abbiamo ottenuto DNA genomico da campioni di saliva di cinque pazienti (A, B, C, D ed E) utilizzando il kit di auto-raccolta del DNA Oragene® (DNA Genotek, Inc., Ottawa, Ontario, Canada). I campioni sono stati quindi arricchiti e ibridati contro sequenze specifiche del bersaglio. L’acquisizione è stata eseguita utilizzando il sequencer Illumina® MiSeq (Truseq Capture) di nuova generazione in modalità accoppiata a 150 bp secondo il protocollo standard per questa piattaforma. La profondità di copertura delle regioni target era superiore a 50x. L’arricchimento e l’analisi sono stati focalizzati sulle sequenze di codifica di cinque trascrizioni (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038.5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2 e PTEN NM_000314.4), 10bp di sequenze introniche e altre regioni presumibilmente causali della malattia. Nel corso dell’inchiesta sono state prese in considerazione anche eliminazioni esoniche, duplicazioni e variazioni del sito di giunzione. Le letture sono state allineate e confrontate con il riferimento al genoma umano (GRCh37). Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) è stato scelto per convalidare le varianti come menzionato da Invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

Disponibilità dei dati

Le sequenze sono state inviate a GenBank (numero di adesione: BankIt2217069 Seq1-MK875826). I set di dati relativi a questo articolo sono disponibili presso l’Istituto Europeo di Bioinformatica EMBL – EBI attraverso il repository EN con numero di adesione allo studio PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

Risultati

Analisi clinica

Sono stati inclusi sette individui di cinque famiglie non correlate (A, B1, B2, C, D1, D2 ed E), come illustrato nella Figura 1. Non abbiamo identificato la consanguineità dei genitori tra i partecipanti. L’origine etnica è stata auto-riportata come mista da ciascun probando. In una panoramica generale, le famiglie A e B sono state osservate per avere tre generazioni successive o più coinvolte. Maschio a femmina sesso rapporto è stato stimato in 1: 6. L’età media all’inclusione era di 42 anni (DS 11,8), mentre l’età media dell’insorgenza delle lesioni era di 28 anni (DS 11,8). Le femmine hanno riportato un picco di incidenza di noduli dopo la gravidanza. Le caratteristiche cliniche classiche di FML includevano noduli molli altamente variabili in numero e dimensioni, situati nel grasso sottocutaneo e confinati al tronco e alle estremità, come illustrato nella Figura 2. Disagio e marcata tenerezza alla palpazione sono stati notati solo nei singoli A. Disturbi gastrointestinali comorbidi erano presenti nei pazienti A, C e D2. Hanno riportato diverticolite e polipi, grave stitichezza cronica e cancro del colon-retto rispettivamente. Quattro pazienti hanno avuto una valutazione istologica delle lesioni sottocutanee. La presenza di adipociti maturi arrotondati da numerosi capillari ha confermato la diagnostica dell’angiolipoma, come indicato da Bancroft e Fletcher et al10, 28 (Figura 2). Altri risultati rilevanti sono descritti nella Tabella 1.

Figura 1 Panoramica del pedigree di famiglie studiate (A–E). Si noti come femmine e maschi sono ugualmente coinvolti e il modello di ereditarietà autosomica dominante con quasi due generazioni successive colpite. La famiglia A ha avuto il più alto numero di generazioni che sviluppano lipomi multipli (a). Il probando A (III 2) era l’unico all’interno del suo gruppo familiare e nella casistica nel riferire il dolore quando è stato esaminato (a). Le frecce indicano i probandi.

Figura 2 caratteristiche Cliniche di FML e istopatologica aspetti di lipomi (SI macchia (10×). I risultati primari includono noduli indolori morbidi, mobili e circoscritti, situati nel grasso sottocutaneo. La distribuzione topografica più comune comprende gli arti superiori (A, B e D), la parete addominale anteriore, la schiena e le cosce (C). Il lipoma di solito presenta un pattern lobulato di adipociti bianchi con nuclei uniformi e una sottile capsula fibrosa (E). Gli angiolipomi sono composti da grasso maturo in associazione con numerosi piccoli vasi sanguigni, che sono prevalentemente capillari. Trombi di fibrina (frecce) è molto comune (F). Immagini per gentile concessione del Dipartimento di Patologia e Genetica Medica, Scuola di Scienze Mediche, UNICAMP.

Molecolare

Il sequenziamento di Sanger ha rivelato due nuove varianti nell’esone 5 del gene HMGA2. Entrambe le varianti sono state identificate nel paziente A e B1. Il primo era una variante eterozigote sinonimo c. 327C>T p.(Asp=) considerato a basso impatto o neutro, basato su diversi strumenti di previsione (VEP, FATHMM, UMD-predictor, SIFT, PROVEAN). Al contrario, la seconda alterazione è stata una variante eterozigote nonsense change c. 328T>C (p.*110Glnext*16) che causa una sostituzione del codone di arresto da parte dell’amminoacido glutammino e la successiva estensione della proteina finale (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). La figura 3 schematizza la struttura del gene HMGA2, i domini di legame proteico e le nuove varianti.

Figura 3 Struttura dell’umano gene HMGA2. (A) Situato su 12q14.3, il gene HMGA2 copre più di 140 kb e comprende cinque esoni. Gli esoni 1, 2 e 3 (caselle blu) codificano per un dominio AT-hook (cerchi blu). Il quarto esone (lilla) codifica per una regione distanziale. L’esone 5 (scatola rosa)codifica il dominio C-terminale della proteina di 109 aminoacidi. (B) Elettroferogramma da pazienti A, B1 e riferimento. Due nuove varianti identiche sono state trovate in questi pazienti. Una variante eterozigote sinonimo c. 327C>T (p.Asp=) e una variante eterozigote no-stop change c.328T>C (p.*110Glnext*16).

La variante c.328T>C (p.*110Glnext*16) è stata definita al 100% patogena o ad alto impatto secondo gli algoritmi menzionati in silico. Tuttavia, il sistema di previsione degli assaggiatori di mutazione ha dimostrato una discrepanza tra le due varianti descritte, come mostrato nella Tabella 3. Il pannello multi-gene mirato di AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA e PTEN nelle famiglie A, B, C, D ed E, non ha rilevato cambiamenti deleteri nelle sequenze valutate.

Tabella 3 Varianti Trovato in Individui A e B1 e Confronto Tra Strumenti di Previsione

Discussione

L’attuale studio si proponeva di identificare le basi molecolari della FML attraverso l’integrazione delle moderne tecniche di sequenziamento come il sequenziamento di Sanger e NGS, combinato con la tradizionale approcci clinici.

A seguito di studi precedenti, la presente ricerca mostra alcune divergenze riguardo ai dati epidemiologici. Abbiamo osservato che esiste un malinteso comune sulla classificazione e la diagnosi di diversi tipi di lipomatosi.7,10,15 Diversi autori sottolineano che gli uomini hanno un’alta tendenza a presentare più lipomi,11,29,30 tuttavia, i nostri risultati mostrano un’apparente alta frequenza di FML nelle femmine. È possibile che questa scoperta rifletta semplicemente un pregiudizio di selezione dovuto alla piccola dimensione del campione, o può anche essere spiegata dal fatto che le donne sono più propense a cercare assistenza medica sanitaria a causa di preoccupazioni cosmetiche.31 Tuttavia, i pedigree indicano che la percentuale di individui colpiti in entrambi i sessi era simile, portando a un rapporto di sesso vicino a 1:1 (10 uomini vs 13 femmine) che può sottovalutare la vera prevalenza di FML.6,8,16 È interessante notare che il numero totale di lipomi osservati nelle donne era più alto rispetto al maschio unico esaminato.1,14

Fattori come il sovrappeso e la crescita esacerbata dei noduli durante e dopo le gravidanze suggeriscono che fattori esogeni (dieta), cambiamenti metabolici (dislipidemia o alterazioni nella desaturazione degli acidi grassi) e meccanismi ormonali possono essere coinvolti nell’iperplasia degli adipociti.32,33 Yee et al hanno confrontato le differenze nella desaturazione enzimatica di stearoil-CoA tra individui con rari disturbi adiposi (RAD) e gruppo di controllo obeso e hanno concluso che gli individui con FML e obesità hanno mostrato i più alti tassi di desaturazione, aumentando così il processo di lipogenesi.32,34

Una scoperta inaspettata era che la paziente A era l’unica all’interno del gruppo casistico e del suo gruppo familiare a manifestare dolore, debolezza quotidiana, affaticamento e comorbidità psichiatrica (depressione cronica e disturbo d’ansia). Questi sintomi sono fortemente associati alla malattia di Dercum, che è considerata una diagnosi differenziale o una variante di FML.35 Sulla base della nuova classificazione della malattia di Dercum proposta da Hansson et al, 36 abbiamo identificato in questo paziente la forma nodulare generalizzata, caratterizzata da dolore intenso sulla superficie del tessuto adiposo e intorno ai lipomi. Un altro studio che supporta questa ipotesi è stato pubblicato da Campen et al37 Hanno descritto una famiglia di nove membri con diagnosi di lipomi multipli che mostravano sintomi variabili che andavano dalla disabilità totale ai noduli asintomatici. Si può, quindi, presumere che la segregazione segua un modello autosomico dominante con espressività variabile e possibilmente rappresenti una manifestazione estrema di FML.

Per quanto riguarda la diagnosi istopatologica, abbiamo evidenziato due tipi principali: lipoma e angiolipoma. Microscopicamente, la caratteristica notevole più comune di angiolipoma è la proliferazione dei vasi sanguigni fini che contengono i microtrombi della fibrina in associazione con gli adipociti maturi.10,28 Gli angiolipomi sembrano avere un’alta incidenza negli uomini giovani adulti che occasionalmente manifestano dolore lieve o dolorabilità. Questo tipo di tumore è anche correlato alla storia del trauma locale o all’uso della terapia steroidea.13,38 Sebbene molti autori riconoscano entrambe le diagnosi come entità patologiche diverse, alcuni casi non fanno questa distinzione a causa di differenze molto sottili tra loro.39 In questo contesto, la nostra analisi conferma che è possibile avere angiolipomi con recidiva familiare e questa diagnosi potrebbe essere parte dell’ampio spettro di FML.40-43 Inoltre, in diverse famiglie sono stati riportati anche lipomi a cellule multiple a fuso, un altro tipo di lipoma.44

Sebbene ci siano diversi studi focalizzati sull’espressione e sull’analisi citogenetica diretta sui lipomi sporadici, pochi studi sono stati preoccupati per le cause costituzionali della FML.2 Ampie serie di lipomi negli adulti confermano molteplici riarrangiamenti strutturali con frequenze che vanno dal 50 al 75%.10,28,45 Tra quelle alterazioni cromosomiche bilanciate, la traslocazione t (3; 12) (q27-28; q13-15) è osservata in quasi il 25% dei tumori.9 Nella maggior parte dei casi, breakpoint colpisce il gene HMGA2 che è composto da 5 esoni e genera una proteina di 109 aminoacidi (Figura 3).18,46,47 Ligon et al hanno riportato il caso di un bambino di otto anni con un riarrangiamento costituzionale che colpisce la banda 12q14.3 (inversione pericentrica de novo) quindi, coinvolgendo il gene HMGA2. Tuttavia, il fenotipo clinico caratterizzato da crescita eccessiva somatica, l’avanzamento dell’età ossea e dentale, tumore cerebellare e lipomi multipli,48 differisce dal nostro casistico.

Abbiamo analizzato le varianti eterozigoti c.327C>T p.(Asp=) e c.328T>C (p.*110Glnext*16) dell’esone 5 del gene HMGA2 in diversi programmi di predizione. L’alterazione sinonimica o silenziosa è stata interpretata come benigna, mentre il cambiamento nel codone di stop di traduzione è stato considerato al 100% patogeno o ad alto impatto. In questo modo, potrebbe indicare che i cambiamenti che coinvolgono la regione 3 UT UTR (non tradotta) innescherebbero la trasformazione neoplastica del gene HMGA2.49 Fusco et al hanno evidenziato il ruolo cruciale del gene HMGA2 nei tumori mesenchimali. Hanno proposto che nel gene HMGA2, la regione 3 UT UTR è generalmente silenziata dal miRNA Let – 7 e qualsiasi alterazione a questo livello, troncamento o fusione con sequenze ectopiche, porta alla sua up-regolazione e di conseguenza a una replicazione anormale delle cellule.46

È un po ‘ sorprendente che nella famiglia B abbiamo rilevato entrambe le nuove varianti solo nella madre (B1). Potrebbe indicare che non si segregano con il fenotipo FML, essendo scartati almeno in questa famiglia come causa eziologica. D’altra parte, il paziente A ha presentato le stesse due nuove varianti ma ha dimostrato un fenotipo altamente indicativo della malattia di Dercum. Nonostante questi risultati promettenti, sono piuttosto difficili da interpretare perché non è stato possibile valutare altri parenti affetti da FML.

Infiltrazione grassa focale e lipomi multipli possono essere presenti in diverse sindromi. La sindrome di Proteus e i CHIODI di GAROFANO (crescita eccessiva asimmetrica lipomatosa congenita, malformazioni vascolari, nevi epidermici, anomalie scheletriche e spinali) sono esempi di mutazioni somatiche in cui è presente la lipomatosi.50,51 D’altra parte, la sindrome di Bannayan-Riley-Rubacalva, la neoplasia endocrina multipla di tipo 1, la sindrome di Cowden e la sindrome di Gardner sono condizioni derivanti da mutazioni germinali che hanno lipomatosi concomitante.52-55 Anche alcune mutazioni che coinvolgono la funzione mitocondriale sono correlate alla crescita anormale del tessuto adiposo principalmente nel tronco superiore e nel collo e il miglior esempio è la malattia di Madelung.56 Tuttavia, il pannello negativo di AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA e PTEN esclude che siano responsabili del fenotipo FML, almeno in questa ricerca.

Conclusione

La FML è una malattia rara ed eterogenea che può sovrapporsi ad altre sindromi dermatologiche come la malattia di Dercum. La storia naturale di FML in questa serie ha rivelato che lo sviluppo delle lesioni era progressivo e ha raggiunto la sua più alta incidenza in individui di mezza età. La FML ha interessato entrambi i sessi e ha presentato una distribuzione topografica con predominanza nelle estremità e nel tronco. Il rapporto tra i sessi tra i pazienti valutati ha mostrato una prevalenza femminile, ma i dati pedigree hanno mostrato una distribuzione più equilibrata. La diagnosi della malattia di Dercum è stata riconosciuta anche in un individuo (paziente A).

L’approccio molecolare ha fornito una visione più approfondita delle basi genetiche della FML e ha tentato di indagare a fondo il maggior numero di geni candidati ad esso collegati. Abbiamo evidenziato l’utilità di NGS oltre al metodo Sanger nella comprensione dell’intero spettro di FML, in quanto potrebbe offrire un’alternativa per l’identificazione eziologica e la caratterizzazione di condizioni genetiche rare in contesti clinici. Le varianti nell’esone 5 del gene HMGA2 non sono state descritte e fino ad ora hanno un significato incerto nella genesi dell’FML. Ulteriori studi, tra cui un numero più significativo di individui affetti e analisi funzionale delle nuove varianti del gene HGMA2, dovrebbero essere intrapresi per determinare meglio la sua funzione biologica nella FML.