INTRODUZIONE

Gli alofili sono un gruppo interessante di organismi che prosperano ad alta salinità. Questi organismi possono essere ampiamente classificati in base alla loro salinità ottimale per la crescita in alofili lievi (1-6%, NaCl/v), alofili moderati (7-15%) e alofili estremi (15-30%) (Madigan e Martinko, 2006). Ricerche approfondite hanno dimostrato che gli alofili non sono limitati a nessuno dei domini di vita, possono essere eucarioti (Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar et al., 2005), o procarioti appartenenti ai domini di Batteri e Archaea. Il genere algale Dunaliella e il gambero di salamoia Artemia (Boetius e Joye, 2009) sono esempi di eucarioti alofili, mentre Halobacterium e Salinibacter sono esempi di procarioti alofili. Il successo degli alofili nella sopravvivenza in ambienti altamente salati è dovuto ad adattamenti fisiologici unici, come la strategia di pompaggio degli ioni e l’accumulo di soluti organici (Oren, 2006; Madigan e Martinko, 2006). A livello genomico e proteomico, gli alofili sono caratterizzati da un alto contenuto di GC e proteine caratterizzate da bassa idrofobicità, sovrarappresentazione di residui acidi, minori propensioni della formazione di eliche e maggiori propensioni della struttura della bobina (Paul et al., 2008).

Gli alofili stanno ora guadagnando più accesso alla microbiologia industriale e alla biotecnologia perché gli alofili crescono ad alta concentrazione di sale e questo riduce al minimo il rischio di contaminazione durante la coltivazione (Oren, 2006). Alcuni esempi di applicazioni biotecnologiche sono l’uso di Micrococcus varians per produrre nucleasi H (Kamekura el al., 1982) e l’uso dei ceppi di tetragenococco alofilo nella produzione di salsa di soia e nella produzione di alcuni enzimi tra cui idrolasi (amilasi, nucleasi, fosfatasi e proteasi) (Oren, 2006). Gli alofili sono anche importanti nella biodegradazione e nel biorisanamento poiché molti alofili sono in grado di degradare idrocarburi e altri composti tossici (Ventosa et al., 1998). Gli alofili possono anche produrre polimeri usati come esaltatori del recupero dell’olio a causa della loro attività tensioattiva e delle proprietà bioemulsionanti (Oren, 2006).

Gli alofili prosperano in ambienti in cui la salinità raggiunge livelli elevati, come oceani, saline solari e laghi salati naturali (Oren, 2007). Il Mar Morto di Giordania è uno dei più grandi laghi salati interni veramente ipersalini del mondo (Boetius e Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan e Martinko, 2006). Oltre ad alta salinità; sale, concentrazione di oltre 340 g L-1 (Oren, 2007), il Mar Morto è unico per la sua alta pressione barometrica (800 mmHg) a causa della bassissima altitudine sotto il livello del mare, pressione parziale dell’ossigeno (PIO2) dell ‘ 8% in più rispetto al livello del mare, radiazione UV unica, bassa umidità (inferiore al 40%) e scarsità di pioggia (Avriel et al., 2011).

Questo studio è stato condotto per classificare le specie batteriche eterotrofiche alofile che prosperano nella zona costiera del Mar Morto di Giordania. La classificazione microbica si basa sulla morfologia coloniale e cellulare, nonché sulla somiglianza nel gene rRNA 16S.

MATERIALI E METODI

Campionamento: campioni di acqua del mar Morto sono stati raccolti da quattro zone costiere (Fig. 1) a marzo, giugno e ottobre 2011. Le coordinate geografiche e l’altitudine dei siti di campionamento sono riportate nella tabella 1. Le coordinate geografiche e l’altitudine sono state determinate per ogni posizione da (Legenda eTrex C, Taiwan). I campioni di acqua del Mar Morto sono stati raccolti in una bottiglia di vetro sterile pulita da 1 L, lasciando abbastanza spazio per la testa nella bottiglia e trasportati immediatamente al laboratorio.

Analisi fisico-chimica dei campioni: Sono stati determinati la temperatura, il pH, i solidi totali disciolti (TDS) e la domanda biologica di ossigeno (BOD) dei campioni di acqua. Temperatura dell’acqua, pH e salinità sono stati misurati in situ. La temperatura dell’acqua e il pH sono stati misurati da un phmetro portatile (Microcomputer pHmetro T19000, Trans Instruments). La salinità è stata misurata da un rifrattometro di salinità palmare. BOD è stato misurato in (Acqua, Ambiente e Regioni aride research Center presso Al al-Bayt University, Giordania). I campioni di acqua sono stati trasferiti in una nuova bottiglia di vetro, quindi sono stati aggiunti 1 ml di tampone fosfato, solfato di magnesio, cloruro di calcio, soluzioni di cloruro di ferro per litro di campione d’acqua. Il campione è stato quindi portato alla temperatura di 20±3°C e saturato con aria filtrata senza organico. Il pH del campione è stato controllato. Se il campione non era nell’intervallo 6,5-7,5, è stato aggiunto acido solforico o idrossido di sodio per portare il campione all’intervallo di pH richiesto (6,5-7,5) e la concentrazione aggiunta non ha diluito il campione più dello 0,5%. Il campione è stato portato alla temperatura di 20°C prima di effettuare diluizioni. Il volume adatto del campione è stato poi trasferito alle bottiglie del BOD. La bottiglia è stata riempita con acqua di diluizione sufficiente per spostare tutta l’aria senza lasciare bolle. L’ossigeno disciolto (DO)è stato determinato utilizzando un analizzatore DO e qualsiasi contenuto spostato è stato sostituito con acqua di diluizione e tappo ermeticamente. La bottiglia è stata incubata per 5 giorni a 20°C. Successivamente, è stato determinato il DO e il BOD è stato calcolato seguendo la differenza tra volume iniziale e volume finale.

Arricchimento, isolamento e colorazione gram: Per arricchire i campioni di acqua, l’acqua del Mar Morto (10 mL) è stata trasferita a 90 mL di liquido ad alta salinità e incubata a 30°C al buio con agitazione (100 rpm). Dopo circa 12 h, un ciclo di coltura di arricchimento è stato striato su un mezzo di sale minerale solido modificato e le colonie separate sono state quindi sottoculturate. Anche le scorte di glicerolo degli isolati sono state preparate e conservate a -20°C per ulteriori analisi. Le cellule sono state macchiate di Gram ed esaminate al microscopio.

16S rRNA gene sequencing and analysis: 16S rRNA gene sequencing amplification and sequencing was carried out by Macrogen Inc., Seoul, Corea del sud, secondo il seguente metodo: giovani colonie di ceppi batterici sono stati sospesi in un 1,5 mL provetta contenente 0,5 mL di soluzione salina sterile e quindi centrifugato a 10.000 rpm per 10 min il surnatante è stato rimosso e il pellet è stato sospeso in 0,5 mL di InstaGene Matrice (Bio-Rad, USA) e incubate a 56°C per 30 min e poi riscaldata a 100°C per 10 min. Dopo il riscaldamento, il surnatante è stato utilizzato per la PCR. La PCR è stata effettuata miscelando 1 µL di DNA del modello con 20 µL di soluzione di reazione PCR. 27F / 1492R primer (27F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: 5 ‘- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) sono stati utilizzati per l’amplificazione e poi 35 cicli di amplificazione sono stati eseguiti a 94 ° C per 45 sec, 55 ° C per 60 sec e 72 ° C per 60 sec. Primer PCR non incorporati e DNTP sono stati rimossi dai prodotti PCR da Montage PCR Clean up kit (Millipore). I prodotti PCR purificati di circa 1.400 bp sono stati sequenziati da primer 518F/800R (518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Il sequenziamento è stato eseguito utilizzando Big Dye terminator cycle sequencing kit v. 3.1 (Applied BioSystems, USA). I prodotti di sequenziamento sono stati risolti con un sistema di sequenziamento del DNA automatizzato Applied Biosystems modello 3730XL (Applied BioSystems, USA) presso la Macrogen, Inc., Seoul, Corea.

Le sequenze sono state analizzate e confrontate con il database nucleotidico pubblico utilizzando il sito web NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Sequenze dei parenti più stretti sono stati poi recuperati dal database e utilizzati per costruire un albero filogenetico utilizzando MEGA5 (Tamura et al., 2011). Contenuto GC le sequenze sono state calcolate da Oligo Calculator (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

RISULTATI

Proprietà fisico-chimiche dei campioni: i campioni di acqua del Mar Morto erano molto salini (36-38%). I valori di pH dei campioni erano bassi e vanno da 5,6 a 6,3. Questo indica la proprietà leggermente acida dell’acqua di mare. Il valore del BOD era molto basso (1-2 mg O2 L-1) indicando un contenuto di materiale organico molto basso nel campione. Le proprietà fisico-chimiche sono riportate nella Tabella 2.

Conteggio batterico vitale eterotrofico: i risultati del conteggio delle placche vitali hanno rivelato un numero molto basso di unità formanti colonie in ciascun campione (200-6000 CFU mL-1). Il conteggio dei CFU è mostrato più dettagliatamente nella Tabella 3.

Isolamento e classificazione dei batteri eterotrofi alofili: In questo studio, abbiamo isolato 44 ceppi batterici eterotrofi alofili. Undici ceppi batterici su 44 sono stati considerati diversi in base alla morfologia coloniale, alla colorazione di Gram e alla morfologia cellulare. Sette su undici ceppi diversi erano Gram-positivi e 4 su 7 erano Gram-negativi. I ceppi batterici sono stati identificati sulla base di analisi del gene 16S rRNA e sono stati trovati ad appartenere al dominio dei batteri. Il parente più prossimo di ogni ceppo batterico isolato è mostrato nella Tabella 4 e Fig. 2. Tutte le sequenze hanno mostrato un contenuto di GC relativamente alto (fino al 58%).

DISCUSSIONE

Sono state determinate e analizzate le proprietà fisico-chimiche dei campioni di acqua del Mar Morto. La percentuale di salinità è risultata molto elevata (fino al 38%). Questa è una caratteristica tipica dell’acqua del Mar Morto che la rende una delle famose salamoie “athalassohaline” (Oren, 2007). Il pH dell’acqua del Mar Morto è stato trovato leggermente acido (5,6-6,3) rispetto al pH (7,5-8) nelle salamoie talassoaline (Oren, 2007). BOD dei campioni erano molto bassi (1-2 mg O2 L-1) riflettendo basso materiale organico in acqua che potrebbe essere utilizzato da batteri eterotrofi. Queste condizioni fisico-chimiche influenzano indubbiamente negativamente la diversità microbica. Pertanto il numero di cellule vitali nei campioni testati era molto basso (non più di 6×102 CFU mL-1) rispetto all’acqua di mare aperto. I conteggi di batteri eterotrofi nelle acque marine sono solitamente nell’ordine di 105-106 batteri mL-1 (Zweifel e Hagstrom, 1995; Madigan e Martinko, 2006). Questi numeri sono derivati da tecniche di colorazione fluorescente aspecifiche (Zweifel e Hagstrom, 1995) che di solito danno numeri più alti rispetto al metodo di conteggio delle piastre praticabili. Le prime pubblicazioni sulla conta batterica nel Mar Morto sono state fatte con la microscopia. Il numero di cellulare era circa 1.9×106 cellule mL1 e durante una fioritura di alobatteri rossi la densità della popolazione ha raggiunto 1, 9×107 ma è diminuita dopo le falene a 5×106 (Oren, 1983).

La ricerca sugli organismi alofili che abitano il Mar Morto iniziò molto presto nel 1892 quando i batteri furono isolati dal genere Clostridium dal fango (Oren, 2002). Più tardi, in un breve articolo pubblicato nel 1936, ha dato la prima descrizione di una comunità microbica indigena adattata alle condizioni estremamente dure del Mar Morto (Oren e Ventosa, 1999). Da quel momento, la nostra conoscenza sugli aspetti biologici del Mar Morto si sta espandendo e accumulando. Abbiamo condotto questa ricerca per espandere le nostre conoscenze sui batteri eterotrofi alofili che prosperano nella zona costiera del Mar Morto giordano. Abbiamo isolato diverse specie batteriche. Successivamente, abbiamo isolato e identificato 11 diverse specie di batteri alofili. La maggior parte degli isolati erano Gram-positivi (7 su 11). Anche se i batteri Gram positivi possiedono adattamenti importanti che consentono loro di contrastare lo stress ambientale come l’alta salinità (Battistuzzi e Hedges, 2009). Non è chiaro in letteratura se i batteri Gram-positivi o batteri Gram-negativi siano dominanti negli ambienti ipersalini. In uno studio sugli alofili procarioti recuperati dai sedimenti del lago salato El-Djerid poco profondo in Tunisia, Hedi et al. (2009) ha scoperto che la popolazione batterica dominante appartiene ai batteri spore-formanti Gram-positivi.

Tutti i ceppi isolati in questo studio appartengono al dominio dei batteri. Appartengono a 7 generi diversi nel dominio. Cinque su sette isolati batterici Gram-positivi appartengono al genere Bacillus. Questo genere è stato istituito nel 1872 per includere tre specie, ma ora ci sono 142 specie di bacillo nominate elencate nel Manuale di batteriologia sistematica di Bergey (Logan e de Vos, 2009). I ceppi di bacillus sono in genere ceppi del suolo. I ceppi di bacillus isolati in questo studio appartengono alle seguenti specie B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis e B. cereus. Questi ceppi sono stati incontrati in diversi ambienti salati (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Yoon et al., 2004; Al-ZaZaee et al., 2011). Per esempio, B. licheniformis è stato precedentemente recuperato dai sedimenti marini da Miranda et al. (2008), mentre B. pumilus è stato isolato da organismi marini come ostriche, granchi e pesci oltre ai sedimenti da Parvathi et al. (2009). B. hwajinpoensis è stato recuperato dall’acqua di mare del mare Orientale e del Mar Giallo in Corea (Yoon et al., 2004). E infine B. cereus, un batterio comune del suolo, è stato riscontrato nelle acque reflue ma con proprietà alofile (Al-ZaZaee et al., 2011). Parete cellulare spessa, alto contenuto di peptidoglicani (oltre il 90% della parete cellulare) (Madigan e Martinko, 2006), alto contenuto di GC e formazione di spore resistenti sono le ragioni principali per la sopravvivenza del bacillo in condizioni difficili come l’alta salinità. Va notato che il ceppo DSD32 (identificato come B. cereus) ha la somiglianza molto bassa con il suo parente più prossimo B. cereus. Questo ceppo può rappresentare una nuova specie del genere Bacillus basata sul gene rRNA 16S.

Gli altri due batteri Gram-positivi sono ceppi di Arthrobacter sp. e Kocuria rosea. Le specie di arthrobacter sono ampiamente distribuite in natura, specialmente nel suolo (Funke et al., 1996) ma non è molto comune in ambienti ipersalini. La Kocuria rosea è considerata una specie moderatamente alofila ed è stata recuperata da diversi ambienti salini come acque saline aperte poco profonde e alcuni ceppi di Kocuria rosea crescono in modo ottimale alla concentrazione di NaCl del 30% (Wright e Tanaka, 2002).

I batteri gram negativi erano meno frequenti nei nostri campioni (4 su 11). Tuttavia, la letteratura pubblicata mostra che questi isolati non sono rari negli ambienti salati. Uno dei ceppi isolati è stato identificato come Vibrio alginolyticus. Quest’ultima specie è in realtà comune nei campioni marini (Molitoris et al., 1985) ed è stato incontrato in acqua di mare marina. Il ceppo ha importanza medica perché può causare infezioni complicate della pelle e dei tessuti molli (Sganga et al., 2009). Ancora più importante, alcuni ceppi di Vibrio alginolyticus sono stati trovati per produrre tetrodotossina, una forte neurotossina (Noguchi et al., 1987). Un altro batterio Gram-negativo identificato in questo studio è il Chromohalobacter salexigens. Questa specie è stata prima isolata e descritta come la specie moderatamente alofila Halomonas elongata e poi proposta come nuova specie di Chromohalobacter (Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli è un’altra specie identificata in questo studio. Questo ceppo non è raro anche per gli habitat salini. È stato recentemente isolato dalla marea piatta del mar Giallo in Corea ed è stato descritto come specie alofila da Yoon et al. (2005). L’ultimo ceppo appartiene a Salinivibrio costicola. Questa specie è stata descritta per la prima volta come Vibrio costicola, ma le sue caratteristiche fenotipiche e genotipiche la distinguevano dalle specie del genere Vibrio. Pertanto, il ceppo è stato posto in un nuovo genere separato chiamato Salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola è moderatamente alofilo ed è stato originariamente isolato dal cibo salato e cresce in modo ottimale in media contenenti sali 10% (Mellado et al., 1996). Un membro del genere Salinibacter, S. ruber, è un modello interessante per lo studio dell’adattamento dei microrganismi alla vita ad alte concentrazioni di sale (Oren, 2007).

CONCLUSIONE

L’acqua del Mar Morto proveniente dalla zona litoranea è caratterizzata da elevata salinità, basso pH, basso contenuto di materiale organico (basso BOD) e trattiene diverse specie di batteri eterotrofi appartenenti a generi sia gram-positivi che Gram-negativi tra cui Arthrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus e Erythrobacter.

RICONOSCIMENTO

Questo studio è stato supportato dal decanato della ricerca accademica presso l’Università Al al-Bayt, in Giordania, decisione del Consiglio della ricerca scientifica nella riunione numero 2/2010/2011. Pertanto, l’autore vorrebbe apprezzare l’assistenza finanziaria fornita dall’Università.