Kísérleti design tanulni rendszer

2012-Ben 300 mag gyorsan kerékpározás Brassica rapa növények (Wisconsin Gyorsan Növények Standard Vetőmag, magas genetikai variáció) kapott a Carolina Biológiai Kellékek, felnőtt egy phytotron alatt szabványosított talaj, fény, valamint az öntözés feltételei. Ezek a növények teljesen kirekesztettek (önellenesek), és elég állandó genetikai variációt hordoznak ahhoz, hogy könnyen reagáljanak a kiválasztásra58, 59. Ebből a 300 növényből 108 teljes sib vetőmagcsaládot hoztak létre mesterséges kereszteződések (csak keresztekből származó vetőmagcsaládok, ahol mindkét szülő gyümölcsöt termelt). Ezt a 108 teljes sib vetőmagcsaládot használták a kísérlet kezdő populációjaként.

a kísérlet első generációja esetében három kezelési csoportot hoztak létre a 108 család segítségével, hogy minden egyes család képviseltesse magát minden kezelésben a genotípus kezelésére a kezelések között (kiegészítő ábra. 1). Ezért minden kezelés 108 növényből állt (108 vetőmagcsaládot képviselve), amelyeket három ismétlésre osztottunk (A,B,C), amelyek mindegyike 36 növényt tartalmaz. A kezelések során a replikációkat izolált vonalakként tartották 9 generáció alatt (nem történt keresztezés a replikátumok között), hogy független, megismételhető evolúciós változásokat lehessen értékelni. Az összes replikáció növényeit a fitotronban standardizált talaj (Einheitserde classic), könnyű (24 órás fény) és öntözési körülmények között termesztették. Minden növény fenotípusos volt minden második generációban, az 1. generációval kezdve. Az 1. és 3. generáció virágillat-adatai technikai problémák miatt elveszettek, ehelyett a 4. generációból gyűjtötték az illatot. Virágos illat adatok 1. generáció kapott, miután a kísérlet végén újra növekvő növények, a kiindulási generáció gyűjtése illat, egy növény, mind a 108 mag családok. Így az első generációból összesen 108 növényt (mindegyik replikációból 36-ot) vettek fel virágos illatra a 9. generációs növényekkel egy időben.

Kísérleti evolúció beporzás kezelések

A tanulmány régen három beporzó kezelések: poszméhek (‘BB’, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Svájc), hoverflies (‘HF’, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Németország), valamint a kézi beporzás. Mindkét rovar a természetben sok Brassicaceae-faj virágait látogatja meg, de különböző funkcionális beporzó kategóriákat képvisel, és kimutatták, hogy a természetes szokásokban bőségesen változik46. Az egyetlen beporzófajok használata utánozza a beporzó környezetet, amelyben a legelterjedtebb beporzók funkcionálisan eltérőek. A kontroll kezelés (“CO”) során a véletlenszerűen kiválasztott növényeket kézzel keresztszennyezték.

a beporzást 23 nappal azután hajtották végre, hogy egy repülőketrecben (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) vetették ki az üvegházban szabványosított fényviszonyok mellett, poszméhekkel és lebegő szentjánosbogarakkal. A kísérleteket 09.00 és 1.500 óra között végezték. A darázsokat egy külön repülési ketrecben tartották az üvegházban. A szárnyaslepkéket bábként vásárolták meg és keltetésig nevelték, majd a hím és a nőstény legyeket elválasztották egymástól. Beporzó rovarok voltak engedélyezett takarmány gyors kerékpározás B. rapa növények (növények, a kontroll csoport az adott generáció), valamint a fed további pollen, amíg 3 nappal azelőtt, hogy a beporzás kezelés; utána, csak a pollen, a cukrot megoldás biztosított; 16 h. mielőtt beporzás, beporzó rovarok voltak éhezve.

a beporzáshoz az egyik replikátum összes növényét véletlenszerűen egy 6 × 6 növény négyzetébe helyezték, egymástól 20 cm távolságra a repülési ketrecben. Öt beporzót külön-külön és egymás után adtak hozzá, és minden rovar legfeljebb három különböző növényt látogathatott meg, majd eltávolította a ketrecből;minden rovarot csak egyszer használtak. Összesen 12-15 növény replikátumonként egy vagy több látogatást kapott a beporzók. A teljes átlag (±s.d.) látogatások száma (a látogatott növények) volt 1.35±0.63 a bumblebee-beporzású növények 1.28±0.53 a hoverfly-beporzású növények. A meglátogatott növények esetében feljegyezték a látogatások számát és a meglátogatott virágok számát. A kontrollcsoportban 12 növényt választottak véletlenszerűen egy-egy replikátumra, és mindegyik növényből 5 virágot egy véletlenszerűen kiválasztott apanövény kézzel beporzott; az apákat ugyanazon 12 növény közül választották ki. Minden növény lehet pollen donor egynél több növény, de csak kapott pollen egy növény. A beporzás után a meglátogatott virágokat megjelölték, a növényeket további 30 napig ketrecben tartották, amíg a gyümölcsöket összegyűjtötték. Magvak számlálása, a relatív mag meghatározott számították ki minden növény elosztják az egyes mag által meghatározott, a mag beállítva a szaporodáshoz. Ezenkívül minden egyes meglátogatott növényre kiszámították a gyümölcsök vetőmagjainak számát. Minden növény esetében a hímek alkalmasságát az előre jelzett apaságnak (a pollenexport eseményeinek száma) becsülték.

a beporzott virágok által termelt összes magból az egyes egyedek vetőmagtermelésének reprezentatív részhalmazát használták fel a következő generáció termesztésére. Minél több magot termelt egy növény, annál több magot járult hozzá a következő generációhoz, amely ismét 36 növényből állt minden egyes replikációhoz. Az egyes meglátogatott növények vetőmag-hozzájárulását a következő generációba számították ki minden replikációra: 36/(a vetőmagok/egyedi vetőmagkészlet többszöröse). A 0,5 alatti értékeket 1-re kerekítették.

beltenyésztési depresszió

a kísérlet során a beltenyésztési depressziót a vetőmag tömegének és csírázási sebességének mérésével számszerűsítették, az utóbbit a replikátumonként csírázott magok százalékában. Hogy ellenőrizzék a tulajdonság-változások miatt beltenyészet, a depresszió, a magok által termelt növények a 9 nemzedék nőtt (ami a 10 generáció), valamint a kézzel átlépte a ismétlések belül a kezelések, annyira, hogy a növények az egyes párhuzamos volt pollen donor, virágport fogadó a növények két különböző ismétlések (♀Egy-♂C, ♀B-♂Egy, ♀C-♂B). Az ismétlések ezen kombinációin belüli kereszteződések véletlenszerűek voltak. A kapott magok közül (a tizenegyedik generáció) vetőmagcsaládonként egy egyedet termesztettek (36 növény replikátumonként) ugyanolyan körülmények között, mint a kísérlet során. Ezek közül az egymás közötti kereszteződések közül a vonásokat ismét megmérték és a vonások végső összehasonlítására használták a kezelési csoportok között.

növényi tulajdonságok

a legtöbb tulajdonságot, beleértve a virágos illatot is, a beporzás előtt, a vetés után 19-21 nappal mérték. Virágonként három véletlenszerűen kiválasztott virág sziromszélességét, hosszát, pistil hosszát és virágátmérőjét elektronikus féknyereggel (0-150 mm-es digitális féknyereg,TOOLCRAFT) mértük. Nektárt három virágot gyűjtöttek, 1 µl micro kapilláris cső (Blaubrand, Wertheim, Németország), valamint a kötet mérésével hosszát nektár oszlop a micropipette a féknyereg. A számszerűsítéshez három virág átlagát használták. 157 növény esetében a nektár cukortartalmát derivatizációval és gázkromatográfiás analízissel határozták meg. Ehhez nektárt továbbítottak a szilikagélben tárolt papír szűrésére. A nektárt tartalmazó szűrőpapíron lévő szektort kivágták a szűrőpapír többi részéből, a nektárt pedig 1 ml nagy tisztaságú Mili-Q vízben eluálták úgy, hogy a hígítást 90 percig rázták 400 r.p.m. 60 °C-on egy laboratóriumi rázógépen. Ezt követően az oldat 50 µl-ét 60 °C-on szárították, és 100 µl vízmentes piridin (Fisher Scientific, Geel, Belgium), hexametilszilazán (Sigma-Aldrich, Buchs, Svájc) és trimetilkloroszilán (Sigma-Aldrich, Buchs, Svájc) keverékéből származtattak (10:5:3). Ezt követően a mintákat GC–MS futtatta a ref. 32. A virágonkénti és virágzatonkénti teljes cukormennyiséget a különböző cukrok (fruktóz, glükóz, szacharóz és szorbit) összegeként számítottuk ki. A nektárcukor-tartalom és a nektármennyiség közötti korreláció pozitív és magas volt (r156=0, 732, p<0, 001), így a többi növény esetében csak a nektármennyiséget határozták meg. A virágos illatgyűjtést a bioassays előtt nem romboló módon végezték el az összes növényi virágzatból, amint legalább öt virág nyitva volt. A fejtér szorpcióját push-pull rendszerrel használtuk59, 60. A növények virágzatát korábban sigmacote-val (Sigma-Aldrich) bevont üveghengerekbe zártuk, Teflon lemezzel zárva. A nyitott virágok számát minden növényre számolták. A környező levegőt 100 ml min−1 vályú aktív szénszűrővel toltuk az üveghengerbe. Ezzel egyidejűleg az üveghengerből levegőt húztak 150 ml min−1 áramlási sebességgel egy ∼30 mg Tenax TA-val töltött üvegcsővel (60/80 mesh; Supleco, Bellefonte, PA, USA). Az üres üveghengerek levegőjét levegővezérlésként gyűjtötték össze. A virágos volatilokat két órán keresztül gyűjtötték egy fitotronban standardizált fény-és hőmérsékleti körülmények között. A volatilok mennyiségi meghatározását gázkromatográfiával, tömegszelektív detektálással (GC–MSD) végezték. A mintákat egy GC-be (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) injektáltuk egy többcélú mintavevővel (MPS; Gerstel, Müllheim, Németország), egy Gerstel termikus deszorpciós egységgel (TDU; Gerstel), hideg befecskendező rendszerrel (CIS; Gerstel). A termodeszorpcióhoz a TDU−t 30-ról 240 °C-ra hevítettük 60 °C min-1 sebességgel, majd végső hőmérsékleten 1 percig tartottuk. A CIS-t -150 °C-ra állították a TDU-ból származó eluáló vegyületek csapdázása során. Injekcióhoz a CIS−t 250 °C-ra melegítették 12 °C s-1 sebességgel, a végső hőmérsékletet pedig 3 percig tartották. A GC-t HP-5 oszloppal szerelték fel (0,25 mm átmérőjű, 0,25 µm filmvastagságú, 15 m hosszú), a héliumot pedig hordozógázként használták 2 ml min−1 áramlási sebességgel. A vegyületazonosítás és a számszerűsítés az Agilent MSD ChemStation Program segítségével történt. A vegyületek számszerűsítését az egyes illatvegyületekre jellemző kiválasztott célionok csúcsterületeinek mérésével kaptuk meg. A specifikus célionokat az összes vegyület szintetikus szabványaiból nyerték; a csúcsterületeket abszolút mennyiségekké alakították át az egyes vegyületekre korábban kapott kalibrációs görbék felhasználásával, három különböző koncentrációban szintetikus vegyületeket használva. Az elemzésben csak olyan illatvegyületek szerepeltek, amelyek szignifikánsan nagyobb mennyiségben voltak jelen, mint a légszabályozásban (összesen 14 illatvegyület). Az összes térfogatot PG−ben számították ki az L-1 mintába vett levegőnként.

huszonhárom nappal a vetés után, a beporzás napján rögzítették az egyes növények nyitott virágainak számát és magasságát. A beporzás után (de ugyanazon a napon) a szín-reflexiós spektruma három szirmok különböző unpollinated (ha lehetséges) virágok / növény volt rögzítve fiberoptic spektrofotométer (AvaSpec-2048; Avantes, Apeldoorn, Hollandia) és egy Xenon pulzáló fényforrás (Avalight-XE; Avantes). Egyszerre egy sziromot helyeztek a spektrofotométer alá (kifejezetten a szirom disztális részére összpontosítva), és a százalékos fényvisszaverődést (egy fehér szabványhoz képest) 200-900 nm között 0,6 nm-enként rögzítették átviteli módban. A mért spektrum közül csak a három szirmból 10 nm-enként 260-650 nm-enként mért reflexiós értékek átlagát használtuk fel az elemzésben. A tizenegyedik generációs növényeknél egy-egy kb. 20 növényből álló részhalmazt elemeztek a szín szempontjából, mivel a kísérlet során egyetlen színdarab sem volt kiválasztva. Az ultraibolya elnyelő és visszaverő szirom felületének területét csak a 11. generációs üzemben mérték ultraibolya-érzékeny digitális fényképezőgéppel, kvarclencsével. A virágokról készült képeket és az ultraibolya elnyelő területet az ImageJ szoftvercsomag segítségével számszerűsítették ( https://imagej.nih.gov/ij/).

a beporzó preferencia-vizsgálatokat

a beporzó preferenciákra vonatkozó vizsgálatokat mindkét típusú beporzó esetében elvégezték. Minden egyes replikátum esetében két viselkedési vizsgálatot végeztünk (mindegyik beporzó-kezelés esetében egy). Az egyes replikátumok darázs – és hoverfly-beporzású növényeit (11. generáció) véletlenszerűen párosították és egymás mellé (kb. 30 cm távolság) helyezték egy repülőketrecbe (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m). Egy beporzó került a ketrecbe, és lehetővé tette, hogy látogassa meg az egyik növény. A beporzókat azonnal elkapták, miután megválasztották őket. Minden növénypárt egy beporzóval vizsgáltak.

önkompatibilitás és autonóm selfing

az önkompatibilitás teszteléséhez az első (15 növény / replikátum) és a tizenegyedik generációból (30 növény / replikátum) növesztettünk növényeket. Magcsaládonként egy magot (véletlenszerűen kiválasztott családokból) termesztettek, növényenként két virágot pedig anthesisben öntöttek. Az egyes növényeknél az önálló virágonként előállított vetőmagok átlagos számát az önkompatibilitás mérésére használták.

az autonóm Önportrék teszteléséhez a 11.és 1. generáció minden kezeléséből (összesen 162 növényből) kb. 12 növényt (egy magot családonként) termesztettünk. 30 nap elteltével, amikor kb. 20 virág kinyílt, minden növényben gondosan kivágták a maradék rügyeket, és feljegyezték a megnyitott virágok számát. A növény ezután lehetővé tette a gyümölcsök kifejlesztését anélkül, hogy rovarok hozzáférnének a növényekhez. A gyümölcsök érése után magokat gyűjtöttek, és minden egyes növényre számolták és lemérték a magok számát. Az autonóm Önportrék méréseként a nyitott virágonkénti gyümölcsök és a gyümölcsenkénti vetőmagok számát használták. Mivel néhány növénynek nagyon sok gyümölcse volt nyitott virágonként, ezeket a kiugrókat töröltük az autonóm Önportrék végső összehasonlításához. A következő kiugró értékeket törölték: 1 az 1. generációban; a G11-ben: 2 a BB-ben, 3 a HF-ben, 2 A CO-ban.

statisztikai elemzés

a fenotípusos szelekció elemzéséhez a szelekciós különbségeket és a színátmeneteket úgy számították ki, hogy a növény alkalmasságát a traits61-re regresszálják. Ezt az elemzést külön-külön végezték el a kezelések, de az összes replikáció és generáció együttvéve. Fitneszbecslésként “látogatások számát” használták, amely számolási változó volt, és Poisson eloszlást követett. Egy másik fitness változó, relatív mag set’ volt distibution elfogult a sok nulla értékek; ezenkívül, a vetőmag meghatározott hiányzott az egyetlen férfi fitness összetevője az első növény, meglátogatott, amely nem állított mag-tól, hogy ez a látogatás (mert a beporzó kezdetben nem végezte Brassica pollen). A látogatások száma azonban erősen korrelált a relatív vetőmagkészlettel (BB: R626=0,694, P0,001; HF: r605=0,597, P<0,001). Generalizált lineáris modelleket (Poisson-eloszlással) használtak a kiválasztási gradiensek (többváltozós) és a differenciálások (univariate) kiszámításához minden olyan kezelés esetében, ahol a látogatások száma függő változóként és kovariánsként jellemezhető. Ezenkívül a négyzetes szelekciós gradienseket minden tulajdonsággal és az egyes vonások négyzetes kifejezésével kiszámították a modellhez, majd a gradienseket megduplázták62. A poszméhek és a lebegő szentjánosbogarak közötti szelekciós különbségek ellenőrzéséhez egy általánosított lineáris modellt (Poisson-eloszlással) végeztünk, amely a látogatások számát függő változóként, a kezelést rögzített tényezőként, a növényi tulajdonságokat kovariánsként és az interakciós kezelést*növényi tulajdonság. A kiválasztási elemzés előtt az összes változót standardizáltuk=0-ra és S.d.=1-re (Z-értékek) replikációs szinten. Egy általánosított lineáris modellt is felhasználtak a poszméhek és a hoverfly – beporzású növények közötti látogatási arányok összehasonlítására minden generáción keresztül. A virágszín-spektrofotométer értékeit a fő komponens (PC) analízisével csökkentettük varimax forgással. Az elemzésben csak az egenérték feletti PC-ket használták.

A növénytulajdonságok evolúciós változását a 11. generációs növényekben többváltozós lineáris diszkrimináns funkcióelemzés és univariate general linear models (GLM) alkalmazásával értékelték. A GLM esetében minden tulajdonságot függő változóként használtunk, véletlenszerű tényezőként és LSD post-hoc teszttel rögzített tényezőként kezeltünk. A diszkrimináció hatása a természetes kiválasztódás a drift, értékeltük-e tulajdonság tekintetében nem volt különbség a következetes között ismétlések egy adott beporzás kezelés. A GLM-analízisben egy jelentős “kezelési” hatás a különböző beporzó csoportok közötti tulajdonságkülönbséget jelzi az összes replikátumban, így megkülönböztetve a beporzó-specifikus evolúciót a sodródástól. Drift volna feltüntetni, hogy az evolúciós változások egy (véletlen) ismétlések csak jelzi jelentősége a tényező ‘párhuzamos’ vagy kölcsönhatás ‘párhuzamos’ s “kezelés”. Az önkompatibilitást és az autonóm önképzést a GLM is értékelte, de az első generációs üzemek értékeit is figyelembe vették az elemzésben. A volatilok és a nektár térfogatának elemzéséhez az adatokat ln (1 + x) átalakították a normális eloszlás megközelítésére. A SZÍNVÁLTOZÓKKAL rendelkező GLM esetében PC-elemzést végeztünk a fent leírtak szerint, de a változók előzetes szabványosítása nélkül. A PC-analízist minden kezelésre, ismétlésre és minden generációra együtt végezték el, így a teljes variancia 96,9% – át négy PC magyarázta. A frekvencia nectarless virágok elemezték, külön-külön minden egyes generáció segítségével általánosított lineáris modellek bimodal engedély, a ‘jelenléte nektár’ (igen/nem), mint a függő változó, valamint a kezelést megismételni, mint tényező. A nektarifás és nektár nélküli Virágok jellegzetességeit a kilencedik és a tizenegyedik nemzedékhez hasonlították össze, az általános lineáris modellekkel, a tulajdonsággal mint függő változóval, a “nektár jelenlétével” és a kezeléssel mint rögzített tényezőkkel. Az első választás beállítások a méhecskék meg hoverflies elemeztek binomiális teszt (teszt-prop=0.5; minden ismétlések összevont). A nektár és a növényi tulajdonságok közötti korrelációt minden generáció esetében a Pearson termék-pillanatnyi korrelációk és az LN-transzformált értékek alapján számították ki. A statisztikákat az IMB SPSS statisztikákkal végezték (20.0.0 Verzió, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

rendelkezésre álló adatok