kísérleti tervezés és mintagyűjtés

a kísérletet 1982-ben hozták létre Mengcheng megyében, Anhui tartományban, Kínában (33° 13′ N, 116° 35′ E, 42 m magasság), tipikus mészbeton fekete talajjal. Az éves hőmérséklet 14,8 °C, az éves csapadék 872 mm. Öt trágyázási kezelések a búza-szója vetésforgó hasonlították össze egy teljesen randomizált blokk design, négy ismétlésben (minden telek 70 m2) : (1) ellenőrzése, a nem-trágyázás; (2) NPK, NPK műtrágyák, amely karbamid (180 kg N ha−1 év−1), szuperfoszfát (90 kg P2O5 ha−1 év−1), valamint a kálium-klorid (86 kg K2O ha− 1 y−1); (3) NPK + IT, NPK műtrágyák plusz 7500 kg búza szalma-ha−1 év−1; (4) NPK + PM, NPK műtrágyák plusz 15,000 kg friss sertés trágya ha−1 év−1; (5) NPK + CM, NPK műtrágyák plusz 30 000 kg friss tehéntrágya ha−1 év−1. Az NPK + WS kezelés, mind a búza szalma volt visszatért a pályára, a sertés trágya az NPK + PM-kezelés, – a tehén trágya az NPK + CM-es volt a hasonló mennyiségű szerves szén a hozzáadott búza szalma. Ezen túlmenően a trágyázási kezeléseinkben szereplő, ellentétes típusú műtrágyák különböző mértékben állnak rendelkezésre a növények és a mikrobák számára, pl. a labilisabb (sertéstrágya), az ellenszenvesebb (búzaszalma és tehéntrágya). A trágyázási kezelések széles skáláját használtuk annak érdekében, hogy eredményeinket reprezentatívvá tegyük, és alkalmazható legyen a kontrasztos kezelési gyakorlatokra.

a búzacsoport körül ástunk (2017.április 20-án a búzatöltési szakaszban 30-40 búzanövényt tartalmaztunk), hogy a gyökérrendszerek a lehető legaktívabbak maradjanak. Ezután a gyökerekhez szorosan tapadt rhizoszféra talajt csiszolták. Ugyanakkor a termőtalajt (0-15 cm mély) ömlesztett talajként gyűjtötték össze egy csiga corer segítségével (körülbelül 20 cm-re a növényektől). Az összegyűjtött talajt egy 2 mm-es hálón átszitáltuk, hogy eltávolítsuk a szennyeződéseket, például a gyökereket és a köveket. A talaj egy részét 4 °C − on tárolták kémiai analízis céljából, a többit-40 °C-on tárolták DNS-extrakció céljából.

Talajfizikai-kémiai analízis

egy pH-mérőt (FE20 Five Easy™, Mettler Toledo, Németország) használtak a talaj pH-jának mérésére 1:5 talaj-desztillált víz arány mellett (súly/térfogat). A talaj nedvesség határozták meg gravimetrically szárítással 5 g friss talaj körülbelül 105-108 °C elérni állandó súlyt, majd kiszámítása a súly arány (elpárolgott vizet szárított talaj). A talaj teljes szén-(TC) és teljes nitrogén-(TN) tartalmát a levegőn szárított talaj CNS-2000 analizátorral (LECO, St. Joseph, MI, USA) történő elégetésével határoztuk meg, miután a talajt 0,15 mm-es hálón át szitáltuk. A talaj összes foszfortartalmát (TP) és összes káliumtartalmát a HF-HClO4 emésztés után extrahálták, és a molibdénkék módszerrel, illetve a lángspektrofotometriás módszerrel (Fp640, inasa, Kína) mérték. Oldott szerves szén (DOC) volt kivont hozzáadásával 50 mL-es desztillált víz 5 g friss föld, remeg a 1 h, vákuum szűrés keresztül G4 üvegszálas szűrő egy pórus tér 1,2 µm (Fisher), majd a szén-dioxid-tartalmát, a kivonatok voltak által meghatározott egy teljes szerves szén analyzer (multi N/C 3000, Analytik Jena, Németország). A nitrátot (NO3–N), az ammóniumot (NH4+-N) és az oldott teljes nitrogént (DTN) 5 g friss talaj és 50 mL 2 M KCl arányban extraháltuk. Miután együtt 1 h, a kivonatok voltak szűrőn keresztül egy G4 üvegszálas szűrő egy pórus tér 1,2 µm (Fisher), majd a folyamatos analitikai rendszer (San++ rendszer, Skalar, Holland) használták, hogy elemezze a tartalom NO3–N, NH4+-N, valamint DTN. Az oldott szerves nitrogént (DON) a következő képlet segítségével számítottuk ki: DON = DTN − NH4+-N − NO3–N. a talajban rendelkezésre álló foszfort (AP) 0-mal extraháltuk.5 M NaHCO3 és molibdén kék módszerrel határozzuk meg. A rendelkezésre álló káliumot (AK) 1 M ammónium-acetáttal extrahálták, és láng fotométerrel (Fp640, inasa, Kína) határozták meg (3.Kiegészítő fájl: 1. függelék).

a nitrogén rögzítési sebességének meghatározása

a 15n2-címkézési módszer az egyik leggyakoribb és széles körben alkalmazott módszer az n rögzítési sebesség mérésére . Öt gramm talajt helyeztek 18 × 150 mm-es Balch csövekbe, a fejteret pedig 80% 15n2-t és 20% O2-t tartalmazó szintetikus levegővel helyettesítették. A kezelőszerveket jelöletlen N2 gázzal töltötték meg, és párhuzamosan dolgozták fel. A csöveket vízszintesen inkubáltuk sötétben szobahőmérsékleten 22 napig. A talajminták atom % 15N-ét stabil izotóp arányú tömegspektrométerrel határoztuk meg (Flash 2000 HT/Conflo IV/Delta V, Thermo Fisher Scientific, Németország). Ezután kiszámítottuk a nettó potenciális n rögzítési sebességet úgy, hogy összehasonlítottuk a 15N-t kapó talajok 15n2-es különbségét az ellenőrzéshez képest.

nagy áteresztőképességű szekvenálás és bioinformatikai analízis

a DNS extrakcióhoz, 0.5 g friss talajt használtunk a gyors DNS SPIN készlettel (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). A nifH géneket nifh-F/nifH-R (5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCCACCACCAC-3′)/(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCATCATCAT-3′) primer párokkal erősítették . PCR reakciók végeztek, 20 µL reakció, amely 4 µL 5 × FastPfu puffer, 2 µL, 2,5 mM-es dNTPs, 0.8 µL 5 µM előre alapozó, 0.8 µL 5 µM fordított primer, 0.4 µL fastPfu Polimeráz, 10 ng templát DNS -, illetve kétágyas desztillált víz (ddH2O). Az erősítést 3 percig 95 °C-on, 30 másodpercig 95 °C-on, 30 másodpercig 55 °C-on, 45 másodpercig 72 °C-on, 10 percig pedig 72 °C-on végezték. A PCR-amplikonokat agaróz gél DNS-tisztító készlet (TaKaRa Bio) tisztította, és minden mintához három példányban PCR-amplifikációt végeztek, PCR-termékként egyesítették, majd az Illumina MiSeq PE300 platformon szekvenálták (Majorbio cég Sanghajban, Kínában). A szekvenálás után a nifH nukleotidszekvenciákat a QIIME-1.9.1 csővezeték segítségével elemeztük (http://qiime.sourceforge.net/) . Először is, az alacsony minőségű sorozatok (azok, akik egy minőségi mutató < 20 tartalmazó kétértelmű nukleotidok, vagy nem megfelelő a primer, vonalkód) eltávolították, a fennmaradó sorozatok tovább át az aminosav szekvenciák segítségével a FunGene Csővezeték a Ribosomal Database Project . Azokat a fehérjéket kódoló szekvenciákat, amelyek nem egyeztek meg a nifH fehérjeszekvenciával, vagy amelyek végkodonokat tartalmaztak, elvetették. A fennmaradó szekvenciákat a nifH génadatbázishoz igazították, eltávolítva mind a sikertelen, mind a kiméra szekvenciákat. A többi, kiváló minőségű sorozatok nem operatív rendszertani egységek (Ótusz) 95% – os hasonlóságot UCLUST futó, de novo mód, meg minden singleton Ótusz töröltek.

Co-occupation network analysis

az összes mintával (rhizosphere és bulk soil) együttesési hálózatot építettünk ki, és meghatároztuk az erősen kapcsolódó OTUs fő ökológiai klasztereit. A top OTUs-t, amely a teljes közösség relatív bőségének több mint 80% – át tette ki, választották . Kiszámították az OTUs-K közötti összes párosított Spearman-korrelációt, és eltávolították a korrelációt a Spearman-együtthatóval, amely kevesebb, mint 0,65, a p-érték pedig több mint 0,01 volt. Ez lehetővé tette számunkra, hogy csak az OTUs-ra összpontosítsunk, amely erősen együtt fordult elő, és nagyobb valószínűséggel kölcsönhatásba léptek egymással. A hálózat fő moduljait (ökológiai klasztereket) Gephi (https://gephi.org/) segítségével vizualizáltuk. Az egyes ökológiai klaszterek relatív bőségét a hozzá tartozó fajok standardizált relatív bőségének (z-pontszám) átlagolásával számítottuk ki (további 3. Fájl: 3. függelék).

Statisztikai analízis

az ANOVA és a páros t teszteket a talajváltozók, a domináns mikrobiális taxonok és a különböző megtermékenyítési kezelések közötti mikrobiális alfa-sokféleség összehasonlítására használták (további 3. Fájl: 1. függelék). Ezeket a teszteket SPSS 21 használatával hajtották végre. A Mantel-tesztet a diazotróf közösség és a fizikai-kémiai tulajdonságok közötti korrelációk elemzésére használták (további 3.Fájl: 2. függelék). Ezt az R × 32 (3.2.2) “vegán” csomag segítségével hajtották végre. A fő koordináta-analízist (PCoA) használták a diazotróf közösségekben a mintavételi csoportok között jelentős különbségek kimutatására (3.Kiegészítő Fájl: 2. függelék). A PCoA-t az R × 32 (3.2.2) “lordsv” csomag (http://cran.stat.sfu.ca/) segítségével hajtották végre.

filogenetikai elemzések

a nifH gén elegendő filogenetikai felbontást biztosít az ökológiai vizsgálatokban. A 481 domináns diazotróf filotípus filogenetikai fája az ökológiai klaszterekben FastTree segítségével épült, graflan segítségével ábrázolva . Filogenetikai mintavételezési elmélet lehet analitikusan foglalkoztatott (feltételezve, hogy a véletlenszerű mintavétel a filogenetikai fa, mint a várható filogenetikai sokszínűség a helyi közösségi majd összehasonlítjuk a megfigyelt filogenetikai sokszínűség szerint azok a jóslatok), hogy meghatározza, milyen mértékben diazotrophic közösségi véletlenszerűen jelennek meg (a − 2 + 2), több mint diszpergált (fent + 2), vagy fürtözött (alul − 2). A filogenetikai mintavételi elméletet a “picante” r csomag segítségével hajtottuk végre . A regionális filogenetikai fa véletlenszerű mintavételének előnye, hogy az egyenlőtlen méretű minták összehasonlítására használható a binomiális mintavételi modell alapján . A megfigyelt és várható filogenetikai sokféleség közötti különbségeket az egyes ökológiai klaszterek z-pontszámainak kiszámításával és összehasonlításával határozták meg. Ha a megfigyelt filogenetikai sokféleség kisebb, mint a várható sokféleség (2 alatt), az ökológiai klaszter mikrobiális közösségét filogenetikailag klaszternek tekintik, ami azt jelenti, hogy a szorosan kapcsolódó taxonokat nagyobb valószínűséggel mintavételezik és aktívan választják ki a környezet .

strukturális egyenlet modellezési elemzés

a SEM-t az IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation) segítségével végezték. A talaj fizikai-kémiai tulajdonságainak közvetlen és közvetett hatásainak, valamint a fő ökológiai klaszterek relatív bőségének az N rögzítési sebességre gyakorolt értékelésére használták. A talaj fizikai-kémiai tulajdonságai közé tartozott a talaj pH-ja, a teljes szén, az összes nitrogén és az összes foszfor. A modellben a kezelések (kontroll, NPK, NPK + ws, NPK + PM és NPK + CM) kategorikus változók voltak, két szinttel: 1 (egy adott kezelés) és 0 (még figyelembe vett kezelések). Ezenkívül a bootstrapping-ot arra használták, hogy teszteljék annak valószínűségét, hogy az útvonal-együtthatók nullától különböznek, mivel néhány változó általában nem volt elosztva. Kiszámoltuk továbbá a talaj tulajdonságainak, a trágyázási kezeléseknek, valamint a rhizosphere hatásnak az N rögzítési sebességre gyakorolt standardizált összes hatását (STEs), hogy elősegítsük a SEM értelmezését.

Random Forest modeling analysis

Random Forest regression (R csomag “randomForest”) a normalizált OTUs regressziójára használták különböző kezelésekben. A 10-szeres kereszt-validációs módszert alkalmazták annak meghatározására, hogy az OTUs optimális halmaza korrelál-e az N rögzítési arányokkal . Rangsorolt listák OTUs sorrendben véletlen erdők jelentett jellemző fontossági pontszámok alapján érték el a növekedés Közép-négyzet hiba a nitrogén fixálás aránya megjósolt több mint 100 iterációk az algoritmus. Az 50 marker OTUs-t a minimális átlagos keresztellenőrzési átlag négyzetes hibák alapján választották ki, amelyeket a 10-szeres keresztellenőrzés öt kísérletéből nyertek.