Csont ásványi: új betekintést a kémiai összetétel
Azonosítása HPO4 2− ionok a csont ásványi
A közvetlen szilárdtestalapú Nukleáris Mágneses Rezonancia (ssNMR) kimutatása a protonok honosított a csont ásványi egy ép csont szöveti minta nem lehetséges. Ennek oka az extracelluláris szerves mátrix jelenléte, amelynek különböző jelei uralják a csontszövet mintájának 1H single pulse (SP) ssNMR spektrumát54. A kétdimenziós (2D) {1H}31P Heteronukleáris korreláció (HetCor) ssnmr kísérletben azonban lehetőség van a hidrogén-és foszformagok atomi léptékű térbeli közelségének feltárására az F1 dimenzió elemzésével (Fig. 1A). Sajnos ez a kísérlet időigényes, és a függőleges (F1) Dimenzió 1 órás vetületét eredményezi, viszonylag gyenge jel-zaj arány (S/N) és alacsony digitális felbontás (ábra) mellett. 1B). Ezen korlátozások leküzdéséhez az egydimenziós (1D) {1H-31P}1H kettős kereszt polarizáció (CP) ssNMR kísérletet használtuk. Ez áll a kettős CP transzfer végzett “ott-vissza” módon (1h→31P→1H) (ábra. S1). Először is, ez a kísérlet lehetővé tette számunkra, hogy 31P-szűrt 1H ssNMR csont ásványi anyagot kapjunk egy ép, kortikális 2 éves juh csontszövetmintából, kiváló S/N-vel, viszonylag rövid beszerzési idő (azaz 9 óra) ellenére (ábra. 1C, D). A különböző 1H kémiai környezetek csont ásványi most könnyen megfigyelhető, biztonságosan elemezhető pontossággal. Ami a csont ásványi részecskék belső kristályos magját illeti, a hidroxi-apatit kristályrácsában jelen lévő hidroxilionokat komplex rezonancia formájában figyeljük meg, amelynek középpontjában δ(1h) = 0,0 ppm. Amorf felületi rétegük tekintetében a nem apatitikus környezetben jelen lévő szerkezeti vízmolekulák és savas foszfátfajok egyetlen rezonancia formájában figyelhetők meg δ(1h) = 5-nél.2 ppm és széles rezonancia δ(1h) = 7 és 17 ppm32 között.
Másodszor, ez a kísérlet lehetővé teszi az 1H-detektált CP dinamika vizsgálatát, hogy szelektíven feltárja az 1H magok természetét a 31P magok közelében. Ebből a célból az 1.érintkezési időt (tCP1) 1000 µs-en rögzítették, míg a 2.érintkezési idő (tCP2) 75 µs-től 1000 µs-ig változott (ábra). 2). A mágnesezés egyenletes növekedése figyelhető meg mind a δ(1h) = 0,0, mind a δ(1h) = 5,2 ppm (lásd a fekete szaggatott vonalakat) középpontban, amelyeket korábban OH− ionok és szerkezeti H2O molekulák tulajdonítottak a megfelelő 1H NMR kémiai eltolódásnak megfelelően. Ezzel szemben a széles jel δ(1h) = 7-17 ppm tartományban történő alakulása kezdetben mágnesezésének gyors növekedését mutatja (tCP2 = 300 µs-ig), majd oszcillációs viselkedés jelenlétét követi (tCP2 = 1250 µs – ig-lásd a fekete szaggatott vonalat). Ez az oszcilláló viselkedés az 1H-31P dipoláris (DP-H) oszcillációkra jellemző55, 56. A megfelelő {1h-31P}1h ssNMR spectra felszerelése különböző tCP2 esetén nem egyértelmű a különböző rezonanciák átfedése miatt. Míg a szintetikus HA minták általában szimmetrikus OH – rezonanciát mutatnak32; megmutatjuk, hogy az Ó− rezonancia a csont ásványi különösen összetett, felszerelhető az alábbiak szerint: a fő csúcs δ(1H) = 0.0 ppm körül két vállát csúcsok δ(1H) = -0.7, 0,9 ppm (Fig. S3). A maradék szerkezeti vízrezonancia megfelelően illeszthető egyetlen csúcshoz, amelynek középpontja δ (1h) = 5,2 ppm (ábra. S4). Ezzel szemben a δ(1h) = 7-17 ppm tartományban megfigyelhető savas foszfátfajok széles jelét nem lehet kielégítően felszerelni egyetlen rögzített pozícióval és vonalszélességgel rendelkező csúcskal, különösen rövid érintkezési idő esetén (lásd a tcp2 különböző értékeinek legmegfelelőbb eredményeit az ábrán. S4-bal oldali oszlop). Az illesztési eredmények azonban pontosak, ha két különböző csúcsot használnak rögzített pozíciókkal és rögzített vonalszélességekkel (6,2 ± 0,1, illetve 5,0 ± 0,1 ppm) (ábra). S4 – jobb oldali oszlop). Nem állíthatjuk, hogy ez a széles jel csak két különböző protonkörnyezetnek megfelelő csúcsból áll, de valószínűleg a kémiai környezetek széles eloszlásából áll, ami az NMR kémiai eltolódásainak eloszlásához vezet. Ennek Megfelelően, Ábra. A 3a azt a négy csúcsot mutatja, amelyeket a csont ásványi anyag 31P-szűrésű 1h ssNMR spektrumának elemzésére használtak minden tCP2 értékhez: i. egy δ(1h) = 0,0 (lila) kompozit csúcs és egy δ(1h) = 5,2 (szürke) ppm középpontú csúcs, amelyet mágnesezésük viszonylag lassú és egyenletes növekedése jellemez; valamint (ii) két csúcsok δ(1H) = 9.8 (kék), valamint 14.0 (zöld) ppm mindkét megjelenítése dipoláris rezgések (Fig. 3B). Ez utóbbi két csúcs tekintetében a Hartmann-Hahn (H-H) profil pontos egyezése (ábra. S2) lehetővé teszi, numerikus modellezése a CP kiépítése görbék szerint az egységes spin pár modell számviteli dipoláris rezgések eredő koherens polarizáció át, majd a hatását, 1H spin diffusion57:
HPO4 2− ionok számszerűsítése a csont ásványban
a csont ásványban jelen lévő HPO42− ionok számszerűsítésére került sor. Ebből a célból az OH− és PO43 egyedi 31P NMR-jeleinek vonalai és vonalai-amelyek belső kristálymagot, valamint a H2o és HPO42-t tartalmaznak-nem apatitikus környezetet (amorf felületi réteg) tartalmaznak, amelyeket az ábra mutat. 4B, használták a szerelvény a mennyiségi 31P egyetlen impulzus (SP) MAS ssNMR spektrum egy friss 2 éves juh csontszövet minta (ábra. 5A). A HPO42− és PO43− ionok moláris százalékos aránya a csontos ásványban körülbelül 50/50 ± 5% volt. Amint azt az S9 és S10 füge-ben végzett megfigyeléseink is sugallták, ezt a számítást úgy hajtottuk végre, hogy a HPO42-ionok moláris aránya a részecskék belső kristályos magjában közel 0% volt. Az amorf felületi rétegben jelen lévő HPO42− ionok ilyen nagy moláris aránya tükrözi a csont ásványi részecskék kis méretét: ∼1-5 nm vastagság, ∼10-40 nm szélesség, ∼20-100 nm hosszban1,61,62,63. Mivel megmutattuk, hogy a HPO42− ionok az amorf felületi rétegen belül koncentrálódnak, most meg tudjuk becsülni ennek a rétegnek az átlagos vastagságát egy 2 éves juh csontszövet mintára. Itt egy 4,0 nm vastagságú nanozizált vérlemezkét tekintünk, és feltételezzük, hogy a hidroxi-apatit kristályrácsában és az amorf felületi rétegben jelen lévő foszfátatomok sűrűsége egyenértékű. Ilyen esetben a belső kristályos mag vastagsága körülbelül 2,4 nm (azaz, ami körülbelül kétszer akkora, mint a hexagonális elemi cella hydroxyapatite64 mentén a kristályos tengelyek, illetve a b; a = b = 0.94 nm); míg a vastagsága a külső amorf felületi réteg körülbelül 0.8 nm (azaz, amely akkor felel meg a méret, a hexagonális elemi cella hidroxiapatit mentén, valamint b -, és ezért, egyenértékű a kötegelés csak két foszfát ionok). Tudatában kell lennünk annak, hogy ezek olyan átlagértékek,amelyek megfelelnek a 2 éves juh csontszövet-mintánkban lévő összes szervetlen foszfátion hozzájárulásának. Ezek az eredmények eltérhetnek az idősebb példányok esetében, amelyekben a nem apatitikus környezetek aránya kisebb lehet65 a csont ásványi érése miatt: az amorf felületi réteg apatitikus környezetekké történő fokozatos átalakulása15. Mindazonáltal az itt meghatározott felületi réteg vastagsága (0,8 nm) jó összhangban van a néhány korábbi vizsgálatban javasolt becsült méretekkel: körülbelül egy foszfátegység mérete a fluorapatit-zselatin mezokristályokban66; körülbelül 1-2 nm a szintetikus hidroxi-apatitokban32,67,68.
frissítés a csont ásványi kémiai összetételéről
az itt és máshol bemutatott eredmények45 arra utalnak,hogy a Legros et al által javasolt Érett kortikális csont ásványi anyag átlagos kémiai összetétele.27, Ca8.3□1,7 (PO4)4,3(HPO4 vagy CO3)1,7 (Oh vagy ½ CO3) 0,3□1,7, újra kell gondolni. Valójában ez a képlet nemcsak figyelmen kívül hagyja az amorf felületi réteg jelenlétét, amelynek kémiai összetétele nagymértékben változik a részecskék belső kristályos magjában lévő apatitikus környezetekhez képest, hanem alábecsüli a HPO42− ionok moláris arányát is. A 2 éves juh csontszövet minta naprakész képletének javasolásához először meg kellett határoznunk a CO32-ionok súlyarányát. A B-típusú karbonátokban jelentős mértékben hozzájáruló 4,8%-os értéket az FT-IR elemzések49 (ábra. 5B), amely összhangban van az egyéb csont ásványi mintákra vonatkozó értékekkel3. Ezen kívül a következő paramétereket figyelembe venni: (i) a részecskék kell maradnia elektromosan semleges (mind a belső, mind kristályos mag, valamint az amorf felületi réteg); (ii) a moláris aránya HPO42− ionok relatív, hogy a teljes összeg a szervetlen foszfát ionok korlátozza közel 50% – a szerint a jelen tanulmány; (iii) a diploma karbonátosodás, közel kell lennie a kísérleti érték (4.8% w/w); (iv) a teljes Ca/(P + C) mólarány továbbra is elfogadható, hogy egy csont szövet mintát, én.e.az 1,2–1,53 és végül v) tartományban az amorf felületi rétegben jelen lévő A-típusú, B-típusú és nem apatitikus karbonátionok aránya az FT-IR adatoknak megfelelően kell, hogy maradjon. Miután ezeket a korlátokat egyesítettük, a 2 éves juh csontszövet mintánkból származó érett kortikális csont ásványi anyag átlagos kémiai összetétele a következőképpen közelíthető meg: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. Meg kell jegyeznünk, hogy ez az átlagos kémiai összetétel kizárólag a saját kísérleti eredményeink szerint felel meg a specifikus csontszövetmintánknak. Ezért ez a képlet nem univerzális, mivel a változékonyság a csontminták között különösen a fajtól, az életkortól, az élelmiszer-ellátástól és az érés mértékétől függ.