bevezetés

A halofilek a magas sótartalommal virágzó szervezetek érdekes csoportja. Ezek a szervezetek széles körben osztályozhatók a növekedéshez szükséges optimális sótartalom alapján enyhe halofilekké (1-6%, W/v NaCl), mérsékelt halofilekké (7-15%) és extrém halofilekké (15-30%) (Madigan and Martinko, 2006). Kiterjedt kutatások kimutatták, hogy a halofilek nem korlátozódnak az élet egyik területére sem, eukarióták lehetnek (Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar et al., 2005), vagy prokarióták, amelyek a baktériumok és Archaea területéhez tartoznak. Az alga nemzetség Dunaliella és a sós garnéla Artemia (Boetius and Joye, 2009) példák halofil eukarióták, míg Halobacterium és Salinibacter példák halofil prokarióták. A halofilek sikere a rendkívül sós környezetben való életben egyedülálló élettani adaptációknak köszönhető, mint például az ionszivattyúzási stratégia és a szerves oldatok felhalmozódása (Oren, 2006; Madigan and Martinko, 2006). A genomikus és proteomikus szinteken a halofileket magas GC-tartalom és alacsony hidrofobicitással jellemezhető fehérjék jellemzik, a savas maradványok túlzott ábrázolása, a hélixképződés alacsonyabb hajlamai és a tekercsszerkezet nagyobb hajlamai (Paul et al., 2008).

A halofilek egyre inkább hozzáférnek az ipari mikrobiológiához és biotechnológiához, mivel a halofilek magas sókoncentrációban nőnek, és ez minimálisra csökkenti a termesztés során bekövetkező szennyeződés kockázatát (Oren, 2006). Néhány példa a biotechnológiai alkalmazásokra a Micrococcus varians alkalmazása h (Kamekura el al., 1982) és a halofil Tetragenococcus törzsek szójaszósz előállítása és egyes enzimek, köztük hidrolázok (amilázok, nukleázok, foszfatázok és proteázok) előállítása során történő felhasználása (Oren, 2006). A halofilek a biológiai lebontásban és a bioremediációban is fontosak, mivel sok halofil szénhidrogéneket és más mérgező vegyületeket (Ventosa et al., 1998). A halofilek olyan polimereket is előállíthatnak, amelyeket felületaktív anyaguk és bioemulsifikáló tulajdonságaik miatt az olaj visszanyerésének fokozóiként használnak (Oren, 2006).

A halofilek olyan környezetben virágoznak, ahol a sótartalom eléri a magas szintet, mint például az óceánok, a napkollektorok és a természetes sós tavak (Oren, 2007). A Jordán Holt-tenger a világ egyik legnagyobb szárazföldi sós tava (Boetius and Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan and Martinko, 2006). A magas sótartalom mellett; só, koncentrációja több mint 340 g L-1 (Oren, 2007), a Holt-tenger egyedülálló a magas légköri nyomás (800 Hgmm) miatt nagyon alacsony tengerszint feletti magasságban, parciális oxigénnyomás (PIO2) 8% – kal több, mint a tengerszint, egyedi UV sugárzás, alacsony páratartalom (40% alatti) és Csapadék (Avriel et al., 2011).

ezt a vizsgálatot a Jordán Holt-tenger partvidékén virágzó halofil heterotróf baktériumfajok osztályozására végezték. A mikrobiális osztályozás alapja a koloniális és sejtmorfológia, valamint a hasonlóság a 16S rRNA génben.

anyagok és módszerek

mintavétel: Holt-tengeri vízmintákat gyűjtöttek négy part menti övezetből (1.ábra). 1) 2011.március, június és október. A mintavételi helyek földrajzi koordinátáit és magasságát az 1.táblázat mutatja. A földrajzi koordinátákat és a magasságot az egyes helyszíneken (Etrex Jelmagyarázat C, Tajvan) határozták meg. A Holt – tengeri vízmintákat 1 liter tiszta, steril üvegben gyűjtötték össze, elegendő helyet hagyva a palackban, majd azonnal a laboratóriumba szállították.

a minták fizikai-kémiai elemzése: Meghatározták a vízminták hőmérsékletét, pH-értékét, összes oldott szilárd anyag (TDS) és biológiai oxigénigényét (BOD). A víz hőmérsékletét, pH-ját és sótartalmát in situ-ban mértük. A víz hőmérsékletét és pH-ját hordozható pH-mérővel (mikroszámítógépes pH-mérő T19000, transz-műszerek) mértük. A sótartalmat kézi sótartalom refraktométerrel mértük. A BOD-T A Jordániai al al-Bayt Egyetem víz -, környezet-és száraz régiók Kutatóközpontjában mérték. A vízmintákat átvisszük egy új üvegpalackba, majd literenként 1 mL foszfátpuffert, magnézium-szulfátot, kalcium-kloridot, vas-klorid-oldatokat adunk hozzá vízmintánként. A mintát ezután 20±3°C hőmérsékletre állítottuk, és szerves-mentes szűrt levegővel telítettük. A minta pH-értékét ellenőriztük. Ha a minta nem volt 6,5-7,5 tartományban, kénsavat vagy nátrium-hidroxidot adtak hozzá, hogy a mintát a kívánt pH-tartományba (6,5-7,5) vigyék, és a hozzáadott koncentráció nem hígította a mintát 0,5% – nál nagyobb mértékben. A mintát hígítás előtt 20°C-ra melegítették. A minta megfelelő térfogatát ezután átvisszük a BOD palackokba. A palackot elegendő hígítóvízzel töltötték meg, hogy az összes levegőt kiszorítsák, így nem maradt buborék. Az oldott oxigént (DO) DO-analizátorral határoztuk meg, és minden eltolódott tartalmat hígítóvízzel és dugóval szorosan kicseréltünk. A palackot 5 napig inkubáltuk 20°C-on.ezt követően meghatároztuk a DO-t, és a BOD-ot a kezdeti és a végső DO-mennyiség közötti különbség alapján számítottuk ki.

: A vízminták gazdagítása érdekében a Holt-tengeri vizet (10 mL) 90 mL folyékony, magas sótartalmú közegbe helyeztük, majd 30°C-on sötétben rázással (100 fordulat / perc) inkubáltuk. Körülbelül 12 óra elteltével egy loopful dúsítási kultúra sugárzott a módosított szilárd ásványi só közegen, majd az elválasztott kolóniákat szubkultúrálták. Az izolátumok glicerinkészleteit is elkészítették és -20°C-on tárolták további elemzés céljából. A sejteket Gram-festették és mikroszkóp alatt vizsgálták.

16S rRNA génszekvenálás és analízis: a 16S rRNA génszekvencia-amplifikációt és szekvenálást a Macrogen Inc. végezte. Szöul , Korea, az alábbi módszer szerint: fiatal gyarmatokon a bakteriális törzsek felfüggesztették egy 1,5 mL-es centrifugacsőbe tartalmazó 0.5 mL steril saline oldattal majd centrifugált 10.000 rpm, 10 perc a felülúszót eltávolítottuk, majd a pellet felfüggesztették, 0, 5 mL InstaGene Mátrix (Bio-Rad, USA), valamint inkubálják 56°C-on 30 percig, majd fűtött 100°C-on 10 perc. Melegítés után felülúszót használtak a PCR-hez. A PCR-t úgy hajtottuk végre, hogy 1 µL sablon DNS-t kevertünk 20 µL PCR reakcióoldattal. 27F / 1492r alapozók (27F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′, 1492R: 5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG TÖRVÉNY T-3’) használtak erősítés, majd 35 hangerősítő ciklus végeztek 94°C-on 45 perc, 55°C-on 60 perc 72°C-60 mp. Jogi személyiséggel nem rendelkező PCR primerek pedig dNTPs eltávolították a PCR termékek Montázs PCR Tiszta készlet (Millipore). A körülbelül 1400 bp-os tisztított PCR-termékeket 518f/800R primerek szekvenálták (518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). A szekvenálást a Big Dye terminator cycle sequencing kit v.3.1 (Applied BioSystems, USA) segítségével végezték. A szekvenálási termékeket a Macrogen, Inc.alkalmazott Biosystems model 3730xl automatizált DNS szekvenáló rendszerén (Applied BioSystems, USA) oldották meg., Szöul, Korea.

a szekvenciákat az NCBI BLAST weboldal segítségével elemezték és összehasonlították a nyilvános nukleotid adatbázissal (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). A legközelebbi hozzátartozók szekvenciáit ezután visszakeresték az adatbázisból, és egy filogenetikai fa felépítésére használták a MEGA5 (Tamura et al., 2011). GC tartalom a szekvenciákat az Oligo Calculator számította ki (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

eredmények

a minták fizikai-kémiai tulajdonságai: a Holt-tengeri vízminták nagyon sósak voltak (36-38%). A minták pH-értéke alacsony volt, és 5,6-6,3 között mozgott. Ez a tengervíz enyhén savas tulajdonságát jelzi. A BOD értéke nagyon alacsony volt (1-2 mg O2 L-1), ami nagyon alacsony szerves anyagtartalmat jelez a mintában. A fizikai-kémiai tulajdonságokat a 2. táblázat mutatja.

heterotróf életképes baktériumszám: az életképes lemezszám eredményei nagyon alacsony számú kolóniaképző egységet mutattak ki minden mintában (200-6000 CFU mL-1). A CFU-szám a 3. táblázatban található további részletekben látható.

halofil heterotróf baktériumok izolálása és osztályozása: ebben a vizsgálatban 44 halofil heterotróf baktériumtörzset izoláltunk. A 44 baktériumtörzs közül tizenegyet különbözőnek tartottak a koloniális morfológia, a Gram-festés és a sejt morfológiája alapján. Tizenegy különböző törzsből hét Gram-pozitív és 7-ből 4 Gram-negatív volt. A baktériumtörzseket 16S rRNA génanalízis alapján azonosították, és megállapították, hogy a baktériumok területéhez tartoznak. Az egyes izolált baktériumtörzsek legközelebbi rokonát a 4. táblázat és a 4. ábra mutatja. 2. Minden szekvencia viszonylag magas GC-tartalmat mutatott (akár 58%).

vita

A Holt-tengeri vízminták fizikai-kémiai tulajdonságait meghatározták és elemezték. A sótartalom százalékos aránya nagyon magasnak bizonyult (akár 38%). Ez a Holt-tengeri víz tipikus jellemzője, így az egyik híres “athalassohaline” brine (Oren, 2007). A Holt – tengeri víz pH-ja enyhén savasnak bizonyult (5,6-6,3) a thalassohaline brines (Oren, 2007) pH-jához képest (7,5-8). A minták BOD-ja nagyon alacsony volt (1-2 mg O2 L-1), ami alacsony szerves anyagot tükrözött a vízben, amelyet heterotróf baktériumok használhatnak. Ezek a fizikai-kémiai feltételek kétségtelenül negatívan befolyásolják a mikrobiális sokféleséget. Ezért a vizsgált mintákban az életképes sejtek száma nagyon alacsony volt (legfeljebb 6×102 CFU mL-1) A nyílt tengervízhez képest. A tengeri vizekben található heterotróf baktériumok száma általában 105-106 ml-1 baktérium sorrendben van (Zweifel and Hagstrom, 1995; Madigan and Martinko, 2006). Ezek a számok nem specifikus fluoreszcens festési technikákból származnak (Zweifel and Hagstrom, 1995), amelyek általában nagyobb számokat adnak, mint az életképes lemezszámlálási módszer. A Holt-tengeri baktériumszámokról szóló első kiadványokat mikroszkóppal végezték. A cellaszám körülbelül 1 volt.9×106 ML1 sejtek és a vörös halobaktériumok virágzása során a populációk sűrűsége elérte az 1, 9×107-et, de a lepkék után 5×106-ra csökkent (Oren, 1983).

A Holt-tengeren élő halofil organizmusok kutatása nagyon korán, 1892-ben kezdődött, amikor a baktériumokat a Clostridium nemzetségből izolálták a sárból (Oren, 2002). Később, egy rövid cikkben, amelyet 1936-ban tettek közzé, bemutatta az őslakos mikrobiális közösség első leírását, amely a Holt-tenger rendkívül kemény körülményeihez igazodott (Oren and Ventosa, 1999). Azóta a Holt-tenger biológiai vonatkozásaival kapcsolatos ismereteink bővülnek és felhalmozódnak. Ezt a kutatást azért végeztük, hogy bővítsük ismereteinket a jordániai Holt-tenger partvidékén virágzó halofil heterotróf baktériumokról. Különböző baktériumfajokat különítettünk el. Ezt követően 11 különböző halofil baktériumfajt izoláltunk és azonosítottunk. A legtöbb izolátum Gram-pozitív volt (11-ből 7). Annak ellenére, hogy a Gram-pozitív baktériumok fontos adaptációkkal rendelkeznek, lehetővé teszik számukra, hogy olyan környezeti stresszel, mint a magas sótartalom (Battistuzzi and sövények, 2009). A szakirodalomban nem világos, hogy a Gram-pozitív baktériumok vagy a Gram-negatív baktériumok dominálnak-e hipersalin környezetben. Az egyik vizsgálatban a prokarióta halofilek visszanyert üledékek a sekély el-Djerid sós tó Tunéziában, Hedi et al. (2009) megállapította, hogy a domináns bakteriális populáció Gram-pozitív spóraképző baktériumokhoz tartozik.

ebben a vizsgálatban az összes izolált törzs a baktériumok tartományába tartozik. A tartomány 7 különböző nemzetségéhez tartoznak. A hét Gram-pozitív bakteriális izolátum közül öt a Bacillus nemzetséghez tartozik. Ezt a nemzetséget 1872-ben hozták létre, hogy három fajt tartalmazzon, de jelenleg 142 bacillus faj szerepel a Bergey szisztematikus bakteriológiai kézikönyvében (Logan and De Vos, 2009). A Bacillus törzsek jellemzően talajtörzsek. Az ebben a vizsgálatban izolált Bacillus törzsek a következő B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis és B. cereus fajokhoz tartoznak. Ezek a törzsek különböző sós környezetben találkoztak (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Yoon et al., 2004; Al-ZaZaee et al., 2011). Például B. licheniformis korábban visszanyert tengeri üledékek Miranda et al. (2008), míg B. pumilust a Parvathi et al.üledékeken kívül olyan tengeri élőlényektől izolálták, mint az osztriga, a rák és a hal. (2009). A B. hwajinpoensis a keleti-tenger tenger és a Sárga-tenger tenger tengeréből került elő Koreában (Yoon et al., 2004). Végül B. cereus, egy közönséges talajbaktérium, találkozott a szennyvízben, de halofil tulajdonságokkal (Al-ZaZaee et al., 2011). Vastag sejtfal, magas peptidoglikán-tartalom (a sejtfal több mint 90%-a) (Madigan and Martinko, 2006), magas GC-tartalom és rezisztens spóraképződés a Bacillus túlélésének fő okai olyan kemény körülmények között, mint a magas sótartalom. Meg kell jegyezni, hogy a dsd32 törzs (B. cereus néven azonosítva) nagyon alacsony hasonlóságot mutat a legközelebbi B. cereus rokonával. Ez a törzs egy új fajt képviselhet a Bacillus nemzetségben a 16S rRNA gén alapján.

a másik két Gram-pozitív baktérium az Arthrobacter sp törzsei. és Kocuria rosea. Az Arthrobacter fajok széles körben elterjedtek a természetben, különösen a talajban (Funke et al., 1996), de nem túl gyakori a hipersalin környezetben. A Kocuria rosea-t mérsékelten halofil fajnak tekintik, és különböző sós környezetekből nyerték vissza, mint például a sós nyílt sekély víz, és a Kocuria rosea egyes törzsei optimálisan nőnek 30% – os NaCl koncentrációban (Wright and Tanaka, 2002).

a Gram-negatív baktériumok ritkábban fordultak elő mintáinkban (11-ből 4). Mindazonáltal a közzétett irodalom azt mutatja, hogy ezek az izolátumok sós környezetben nem ritkák. Az egyik izolált törzset Vibrio alginolyticus-ként azonosították. Ez utóbbi faj valójában gyakori a tengeri mintákban (Molitoris et al., 1985), és a tengervízben találkoztak. A törzsnek orvosi jelentősége van, mivel bonyolult bőr-és lágyszövetfertőzést okozhat (Sganga et al., 2009). Ennél is fontosabb, hogy a Vibrio alginolyticus egyes törzsei tetrodotoxint, erős neurotoxint (Noguchi et al., 1987). Egy másik Gram-negatív baktérium, amelyet ebben a vizsgálatban azonosítottak, a Chromohalobacter salexigens. Ezt a fajt először izolálták és a mérsékelten halofil halomonas elongata fajként írták le, majd a Chromohalobacter új fajaként javasolták (Arahal et al., 2001). Az Erythrobacter gaetbuli egy másik faj, amelyet ebben a vizsgálatban azonosítottak. Ez a törzs nem ritka a sós élőhelyeknél sem. Nemrég izolálták a sárga-tengerből Koreában, és Yoon et al halofil fajként írta le. (2005). Az utolsó törzs a Salinivibrio costicola – hoz tartozik. Ezt a fajt először Vibrio costicola néven írták le, de fenotípusos és genotípusos jellemzői különböztették meg a Vibrio nemzetség fajaitól. Ezért a törzset új, különálló nembe, a Salinivibrio-Ba (Mellado et al., 1996). A Salinivibrio costicola mérsékelten halofil, eredetileg sós ételekből izolálták, és optimálisan növekszik 10% sókat tartalmazó közegben (Mellado et al., 1996). A salinibacter nemzetség tagja, S. ruber, érdekes modell a mikroorganizmusok nagy só koncentrációjú élethez való alkalmazkodásának tanulmányozására (Oren, 2007).

a KÖVETKEZTETÉST

a Holt-Tengeri víz, a part menti zóna jellemző a magas sótartalom, alacsony pH, alacsony szerves anyag tartalom (alacsony BOD) visszafogni különböző faj heterotrophic baktériumok tartozó, mind a Gram-pozitív, mind a Gram-negatív nemzetségek beleértve Arthrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus, valamint Erythrobacter.

ezt a tanulmányt a jordániai Al-Bayt Egyetem tudományos kutatásának deanship of academic research támogatta, a Tudományos Kutatási Tanács határozata a 2/2010/2011. Így a szerző szeretné értékelni az egyetem által nyújtott pénzügyi támogatást.