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A. Introduction

Le microscope à lumière composée typique (Fig.1) est capable d’augmenter notre capacité à voir les détails de 1000 fois pour que des objets aussi petits que 0,1 micromètre (um) ou 100 nanomètres (nm) puissent être vus. Les microscopes électroniques étendent encore cette gamme, ce qui nous permet de voir des objets aussi petits que 0,5 nm de diamètre ou environ 1/200 000 e de la taille que nous pouvons voir à l’œil nu. Il va sans dire que le développement et l’utilisation de microscopes ont considérablement amélioré notre compréhension des cellules, de leur structure et de leur fonction.

Figure 1. Microscope composé binoculaire.

B. Grossissement, Résolution et distance de travail

Le grossissement est simplement une fonction de rendre un objet plus grand, par exemple lorsque nous utilisons une lentille manuelle pour agrandir un mot imprimé. Le simple fait d’agrandir un objet sans augmenter simultanément la quantité de détails vus ne fournira pas au spectateur une bonne image. La capacité d’un microscope (ou d’un œil) à voir les détails est fonction de son pouvoir de résolution. Le pouvoir de résolution est défini comme la distance minimale entre deux objets à laquelle les objets peuvent simplement être distingués séparément et est fonction de la longueur d’onde de la lumière utilisée et de la qualité de l’optique. En général, plus la longueur d’onde de la source lumineuse est courte, plus la résolution du microscope est élevée.

La distance de travail est la distance entre l’objectif et l’échantillon. À faible grossissement, la distance de travail est relativement longue. Lorsque vous augmentez le grossissement, la distance de travail diminue considérablement. Les lentilles à immersion dans l’huile touchent paciquement l’échantillon. Soyez conscient de ce changement de distance de travail avec un grossissement croissant afin d’éviter d’endommager vos échantillons.

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C.Parties du microscope optique Composé monoculaire:

Veuillez prendre le temps de vous familiariser avec votre microscope et son utilisation appropriée. Les contrôles des deux marques de microscopes que nous utilisons dans nos cours sont illustrés ci-dessous (Fig. 2).

Figure 2. Contrôles sur les microscopes composés binoculaires Leica et Olympus.

1. Lentille oculaire ou oculaire: les nôtres ont un grossissement de 10x. Les portées que nous utiliserons sont monoculaires (un seul oculaire.)

2. Tube corporel: contient des miroirs et des prismes qui dirigent l’image vers la lentille oculaire.

3. Nosepiece: maintient les objectifs, tourne, note les arrêts positifs pour chaque objectif.

4. Objectifs: généralement 3-4 sur nos lunettes, immersion dans l’huile 4x, 10x, 43x, 100x (bandes rouges). Grossissement total = puissance oculaire x puissance objective.

5. Étape : plate-forme sur laquelle les glissières sont montées pour la visualisation ; certaines portées ont des étapes mécaniques. Apprenez à clipser correctement la diapositive en position.

6. Diaphragme: le diaphragme contrôle la quantité de lumière qui passe à l’échantillon et peut affecter considérablement la mise au point de l’image. APPRENEZ À UTILISER LE DIAPHRAGME LE PLUS RAPIDEMENT POSSIBLE. LA PLUPART DES PROBLÈMES DE MISE AU POINT QUE VOUS RENCONTREREZ SERONT DUS À UN RÉGLAGE INCORRECT DE LA LUMIÈRE.

Nous avons deux types:

• diaphragme à iris: Recherchez un levier juste sous la scène près de l’avant.
• type de cadran: Juste en dessous de l’étage se trouve un cadran rotatif ayant des ouvertures (trous) de tailles différentes; ce type est utile pour créer un pseudo effet de champ sombre.

7. Boutons de mise au point: Situés sur le côté du microscope; le plus à l’extérieur est le foyer fin et le plus à l’intérieur est le foyer grossier.
8. Source de lumière: nos lunettes ont des sources de lumière intégrées. L’interrupteur à bouton-poussoir est situé (le plus souvent) derrière la lentille de lumière sur la base.

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D. Entretien et manipulation du Microscope composé

Il n’y a que quelques règles ABSOLUES à observer dans l’entretien des microscopes que vous utiliserez. Pris en charge, ces instruments dureront plusieurs décennies et continueront à bien fonctionner. Veuillez signaler tout dysfonctionnement immédiatement à votre instructeur.

1. Utilisez TOUJOURS deux mains pour porter la lunette – une sur le bras et une sous la base – SANS EXCEPTION! NE portez JAMAIS la lunette à l’envers, car l’oculaire peut et tombera.

2. Utilisez du papier pour lentilles pour nettoyer toutes les lentilles avant chaque séance de laboratoire et après l’utilisation de la lentille à immersion dans l’huile. N’UTILISEZ JAMAIS, PAS MAINTENANT, PAS JAMAIS, AUTRE CHOSE QUE DU PAPIER POUR LENTILLES POUR NETTOYER LES LENTILLES. D’autres papiers sont trop impurs et rayeront le revêtement optique sur les lentilles. De plus, n’utilisez aucun liquide lors du nettoyage des lentilles – UNIQUEMENT du PAPIER POUR lentilles!

3. Utilisez toujours la technique de mise au point appropriée pour éviter d’enfoncer l’objectif dans une diapositive – cela peut casser l’objectif et / ou ruiner une diapositive coûteuse.

4. Éteignez toujours la lumière lorsque vous n’utilisez pas la lunette.

5. Placez toujours soigneusement le fil hors de danger. Les fils en boucle dans les espaces des jambes invitent à une catastrophe majeure du microscope. Essayez de glisser le fil à travers les poignées du tiroir à côté de votre espace de banc.

6. Remplacez toujours le couvercle du microscope lorsque vous le rangez

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E. Procédure de mise au point: Microscopes composés monoculaires

1. Allumez la source lumineuse.

2. Passez à l’objectif 10x.

3. Reculez sur la mise au point grossière pour relever le morceau de nez.

4. Placez la lame d’échantillon sur la scène et fixez-la dans la bonne position. Regardez la diapositive et placez-la de manière à ce que l’échantillon soit au-dessus de l’ouverture lumineuse de la scène.

5. Objectif inférieur à la limite inférieure (près de la diapositive). Soulevez l’objectif à l’aide du bouton de mise au point grossière jusqu’à ce que vous voyiez l’image se mettre au point, puis s’éteindre à nouveau, puis faites la mise au point jusqu’à ce que vous trouviez la mise au point centrale. Ajustez la mise au point fine de la même manière.

6. Centrez l’image et ajustez la lumière à l’aide du diaphragme.

7. Recentrez et ajustez la mise au point, d’abord grossière, puis fine comme à l’étape 5.

8. Réajuster le diaphragme au besoin.

9. Passez maintenant les objectifs au 43x si un grossissement plus élevé est nécessaire. Réajustez la mise au point fine et la lumière (diaphragme) au besoin.

Nos portées sont parfaitement focales, ce qui signifie que lorsque vous passez d’une puissance faible (100x) à une puissance élevée (430x), une image focalisée à faible puissance restera plus ou moins focalisée à la puissance supérieure. Très probablement, vous devrez réajuster légèrement la mise au point fine et le diaphragme.

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F.Procédure d’immersion dans l’huile

Sur certains de nos microscopes monoculaires et tous les microscopes composés binoculaires, nous avons des lentilles à immersion dans l’huile 100x. Ceux-ci peuvent être identifiés par une bande rouge autour du boîtier de la lentille. À des grossissements supérieurs à environ 500x, la lumière est trop réfractée lorsqu’elle traverse l’air pour obtenir un bon pouvoir de résolution. Ainsi, des optiques pour ces grossissements plus élevés sont utilisées avec une huile minérale de haute qualité comme support de transmission de la lumière. Il est impératif d’utiliser uniquement de l’huile d’immersion et de nettoyer soigneusement l’objectif avec du papier pour objectif après chaque utilisation.

1. Localisez la région d’intérêt sur votre diapositive et centrez-la à 430x.

2. Élever l’objectif à sa limite (i.e., maximisez la distance entre la scène et les objectifs) et faites pivoter l’objectif à mi-chemin vers la position suivante.

3. Placez délicatement une petite goutte d’huile d’immersion directement sur la lame au centre de la région d’intérêt.

4. Tournez l’objectif à immersion dans l’huile en position et, avec précaution, tout en regardant de côté, abaissez-le à l’aide du bouton de mise au point grossière jusqu’à ce que l’objectif entre en contact avec la goutte d’huile. Vous verrez la chute sauter dans une colonne au fur et à mesure que le contact est établi.

5. Abaissez la lentille d’un peu plus puis, en utilisant la mise au point fine et en regardant à travers la lentille oculaire, concentrez-vous sur l’échantillon.

6. Une fois terminé, nettoyez la lentille avec du papier pour lentilles jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’huile et nettoyez la diapositive si elle doit être conservée.

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G. Détermination du diamètre du champ de vision

Vous pouvez estimer la taille des échantillons (par exemple, des cellules) que vous verrez en laboratoire. La meilleure façon de le faire est d’utiliser un micromètre oculaire, un insert de lentille oculaire de précision doté d’une règle gravée dans du verre. Les portées monoculaires que nous utilisons dans les cours d’introduction ne sont pas ainsi équipées, nous utiliserons donc une méthode alternative basée sur la connaissance du diamètre du champ de vision pour votre microscope particulier. Pour ce faire, vous devez déterminer:

• le diamètre approximatif de votre champ de vision à faible grossissement pour votre microscope particulier.
• grossissement total pour chacun de vos autres objectifs.

Sachant cela pour chaque objectif, vous pouvez comparer la taille de l’échantillon avec le diamètre de champ connu et faire une estimation raisonnable de la taille. Cette technique fonctionne pour n’importe quel microscope.

1. Obtenez une échelle de diapositives et positionnez-la sur votre lunette. Une règle métrique transparente fonctionnera également.

2. Mettez-le au point en utilisant l’objectif 10x (100x au total). Les barres d’échelle sont des incréments de 1 mm comme indiqué dans la figure ci-dessous. Ainsi, une barre noire = 0,5mm tout comme un espace.

3. Déplacez la diapositive de telle sorte que le bord d’une barre noire extérieure soit juste tangent au champ éclairé (voir le point « A » ci-dessus).

4. À partir de ce bord, estimez le nombre de barres et d’espaces nécessaires pour traverser le champ de vision. Vous devrez probablement estimer la dernière fraction d’un espace ou d’une barre. Pour la plupart de nos microscopes, il mesure environ 1,8 à 2,0 mm de large. Vous devez vérifier cela sur tout microscope que vous utilisez qui n’a pas de micromètre oculaire.

5. Enregistrez le numéro d’identification et le diamètre de champ de votre lunette à 100x dans votre cahier de laboratoire pour référence future.

6. Ensuite, calculez la largeur du champ à un grossissement total de 430x en utilisant la formule suivante (nous appelons le mag 100x « faible puissance » et 430x « haute puissance »):

(mag faible puissance / mag haute puissance) x diamètre du champ faible puissance (en mm)

Par exemple, supposons que vous déterminiez que le diamètre du champ 100x est de 1,8 mm, à 430x, le diamètre du champ serait:

p>

(100 / 430) x 1,8 mm = 0,418 mm = 418 um (micromètres)

Notez que le diamètre du champ à haute puissance est proportionnel au rapport entre les objectifs basse et haute puissance. Autrement dit, à mesure que vous augmentez le grossissement, le champ de vision réel devient proportionnellement plus petit.

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H.Microscopes optiques Composés binoculaires
Parties du microscope optique

1. Lentille oculaire ou oculaire: les nôtres ont un grossissement de 10x. Les portées que nous utiliserons sont binoculaires (deux oculaires).

2. Tube corporel: contient des miroirs et des prismes qui dirigent l’image vers les lentilles oculaires.

3. Nosepiece: maintient les objectifs, tourne

4. Objectifs: généralement 3-4 sur nos lunettes, immersion dans l’huile 4x, 10x, 43x, 100x (bandes rouges). Grossissement total = puissance oculaire x puissance objective. La plupart de nos jumelles ont des lentilles à position fixe – la scène monte et descend plutôt que la lentille.

5. Scène: Plate-forme mobile sur laquelle les diapositives sont montées pour la visualisation; toutes nos portées ont des étages mécaniques avec des échelles vernier X, Y. Les boutons de mise au point déplacent la scène de haut en bas.

6. Condenseur: Une lentille de sous-étage qui focalise la lumière sur l’échantillon. Nos jumelles ont des condensateurs qui montent et descendent pour focaliser le faisceau lumineux.

7. Diaphragme Iris: le diaphragme est situé juste en dessous de la scène et contrôle la quantité de lumière qui passe vers l’échantillon et peut affecter considérablement la mise au point de l’image.

8. Boutons de mise au point: le plus à l’extérieur est la mise au point fine et le plus à l’intérieur est la mise au point grossière. Sur les jumelles, ces boutons contrôlent le mouvement haut / bas de la scène.

9. Source de lumière: nos lunettes ont des sources de lumière intégrées. L’interrupteur MARCHE / ARRÊT du rhéostat est situé sur la lunette ou sur l’alimentation externe et sert à réguler l’intensité lumineuse.

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I. Procédure de mise au point: Microscopes composés binoculaires

1. Allumez la source lumineuse. Les portées Binoc ont soit une unité intégrée, soit une alimentation externe.

2. Passez à l’objectif 10x.

3. Ajustez la mise au point grossière pour relever le nez (ou abaisser le plateau).

4. Clipser la lame de l’échantillon sur la scène dans la bonne position.

5. Regardez les lentilles oculaires de votre lunette. Un objectif est fixe et l’autre a une bague de mise au point (comme une paire de jumelles). Amenez la lentille aussi près que possible de la diapositive, puis, en regardant uniquement à travers la lentille oculaire fixe, reculez jusqu’à ce que l’échantillon soit mis au point. Ajustez la mise au point fine de la même manière pour l’objectif fixe.

6. Maintenant, en regardant uniquement à travers l’oculaire réglable, ajustez sa mise au point à l’aide de la bague de mise au point autour de l’objectif. Regardez avec les deux yeux (ajustez la distance interpupillaire pour voir un seul champ éclairé rond) et faites des ajustements mineurs pour vous concentrer.

7. Centrez l’image et ajustez la lumière à l’aide de la lentille à condensation, du diaphragme à iris et du rhéostat de la source lumineuse.

8. Recentrez et ajustez la mise au point, d’abord grossière, puis fine comme dans 5.

9. Réajuster le diaphragme au besoin.

10.Maintenant, passez les objectifs à une puissance supérieure. Réajustez la mise au point fine et la lumière (diaphragme) au besoin.

Nos portées sont parfaitement focales, ce qui signifie que lorsque vous passez d’une puissance faible à élevée, une image focalisée à faible puissance restera plus ou moins focalisée à la puissance supérieure. Très probablement, vous devrez réajuster légèrement la mise au point fine et le diaphragme (augmenter la lumière à des puissances plus élevées.

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Department of Biology, Bates College, Lewiston, ME 04240