INTRODUCTION

Les halophiles sont un groupe intéressant d’organismes florissants à haute salinité. Ces organismes peuvent être classés en fonction de leur salinité optimale pour la croissance en halophiles légers (1-6%, p/v NaCl), halophiles modérés (7-15 %) et halophiles extrêmes (15-30%) (Madigan et Martinko, 2006). Des recherches approfondies ont montré que les halophiles ne sont limités à aucun des domaines de la vie, ils peuvent être des eucaryotes (Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar et coll., 2005), ou procaryotes appartenant aux domaines des Bactéries et des Archées. Le genre d’algues Dunaliella et la crevette saumâtre Artemia (Boetius et Joye, 2009) sont des exemples d’eucaryotes halophiles, alors que Halobacterium et Salinibacter sont des exemples de procaryotes halophiles. Le succès des halophiles à survivre dans des environnements très salés est dû à des adaptations physiologiques uniques, telles que la stratégie de pompage des ions et l’accumulation de solutés organiques (Oren, 2006; Madigan et Martinko, 2006). Aux niveaux génomique et protéomique, les halophiles sont caractérisés par une teneur élevée en GC et des protéines caractérisées par une faible hydrophobicité, une surreprésentation des résidus acides, des propensions plus faibles à la formation d’hélices et des propensions plus élevées à la structure de la bobine (Paul et al., 2008).

Les halophiles ont maintenant plus accès à la microbiologie industrielle et à la biotechnologie parce que les halophiles poussent à une concentration élevée en sel, ce qui minimise le risque de contamination pendant la culture (Oren, 2006). Quelques exemples d’applications biotechnologiques sont l’utilisation de Micrococcus varians pour produire la nucléase H (Kamekura el al., 1982) et l’utilisation des souches de tétragénocoques halophiles dans la production de sauce de soja et la production de certaines enzymes dont les hydrolases (amylases, nucléases, phosphatases et protéases) (Oren, 2006). Les halophiles jouent également un rôle important dans la biodégradation et la biorestauration, car de nombreux halophiles sont capables de dégrader les hydrocarbures et d’autres composés toxiques (Ventosa et al., 1998). Les halophiles peuvent également produire des polymères utilisés comme exhausteurs de récupération du pétrole en raison de leur activité tensioactive et de leurs propriétés bioémulsifiantes (Oren, 2006).

Les halophiles prospèrent dans des environnements où la salinité atteint des niveaux élevés, tels que les océans, les salines solaires et les lacs salés naturels (Oren, 2007). La mer morte de Jordanie est l’un des plus grands lacs salés intérieurs véritablement hypersalins au monde (Boetius et Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan et Martinko, 2006). En plus de la salinité élevée; sel, concentration de plus de 340 g de L-1 (Oren, 2007), la mer Morte est unique par sa pression barométrique élevée (800 mmHg) due à une très faible altitude sous le niveau de la mer, une pression partielle d’oxygène (PIO2) de 8% de plus qu’au niveau de la mer, un rayonnement UV unique, une faible humidité (inférieure à 40%) et la rareté des pluies (Avriel et al., 2011).

Cette étude a été menée pour classer les espèces bactériennes hétérotrophes halophiles prospérant dans la zone littorale de la mer Morte de Jordanie. La classification microbienne est basée sur la morphologie coloniale et cellulaire, ainsi que sur la similitude du gène de l’ARNr 16S.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Échantillonnage : Des échantillons d’eau de la mer Morte ont été prélevés dans quatre zones littorales (Fig. 1) en mars, juin et octobre 2011. Les coordonnées géographiques et l’altitude des sites d’échantillonnage sont indiquées dans le tableau 1. Les coordonnées géographiques et l’altitude ont été déterminées pour chaque emplacement par (eTrex Legend C, Taiwan). Des échantillons d’eau de la mer Morte ont été collectés dans une bouteille en verre stérile propre de 1 L laissant suffisamment d’espace pour la tête dans la bouteille et transportés immédiatement au laboratoire.

Analyse physico-chimique des échantillons: La température, le pH, les solides dissous totaux (TDS) et la Demande biologique en oxygène (DBO) des échantillons d’eau ont été déterminés. La température, le pH et la salinité de l’eau ont été mesurés in situ. La température et le pH de l’eau ont été mesurés par un pH-mètre portable (pH-mètre micro-ordinateur T19000, Trans Instruments). La salinité a été mesurée par un réfractomètre portatif de salinité. La DBO a été mesurée dans (Centre de recherche sur l’eau, l’environnement et les régions arides de l’Université Al al-Bayt, Jordanie). Les échantillons d’eau ont été transférés dans une nouvelle bouteille en verre, puis 1 mL de tampon phosphate, de sulfate de magnésium, de chlorure de calcium, de solutions de chlorure de fer par litre d’échantillon d’eau ont été ajoutés. L’échantillon a ensuite été porté à une température de 20±3°C et saturé d’air filtré sans matière organique. Le pH de l’échantillon a été vérifié. Si l’échantillon n’était pas dans la plage de 6,5 à 7,5, de l’acide sulfurique ou de l’hydroxyde de sodium a été ajouté pour amener l’échantillon à la plage de pH requise (6,5 à 7,5) et la concentration ajoutée n’a pas dilué l’échantillon à plus de 0,5%. L’échantillon a été porté à une température de 20°C avant de procéder à des dilutions. Un volume approprié de l’échantillon a ensuite été transféré dans des bouteilles de DBO. La bouteille a été remplie avec suffisamment d’eau de dilution pour déplacer tout l’air ne laissant aucune bulle. L’oxygène dissous (DO) a été déterminé à l’aide d’un analyseur DO et tout contenu déplacé a été remplacé par de l’eau de dilution et un bouchon hermétique. La bouteille a été incubée pendant 5 jours à 20 ° C. Après cela, la DO a été déterminée et la DBO a été calculée comme suit la différence entre la DO initiale et la DO finale sur le volume.

Enrichissement, isolement et coloration de gramme: Pour enrichir les échantillons d’eau, l’eau de mer Morte (10 mL) a été transférée dans 90 mL de milieu liquide à haute salinité et incubée à 30°C dans l’obscurité avec agitation (100 tr/min). Après environ 12 h, une boucle de culture d’enrichissement a été striée sur un milieu salin minéral solide modifié et les colonies séparées ont ensuite été repiquées. Des stocks de glycérol des isolats ont également été préparés et stockés à -20 ° C pour une analyse plus approfondie. Les cellules ont été colorées au gramme et examinées au microscope.

Séquençage et analyse du gène de l’ARNr 16S: L’amplification et le séquençage de la séquence du gène de l’ARNr 16S ont été réalisés par Macrogen Inc., Séoul, Corée, selon la méthode suivante: les jeunes colonies des souches bactériennes ont été suspendues dans un tube à centrifuger de 1,5 mL contenant une solution saline stérile de 0,5 mL, puis centrifugées à 10 000 tr/ min pendant 10 min. le surnageant a été éliminé et le culot a été suspendu dans 0,5 mL de matrice InstaGene (Bio-Rad, USA) et incubé à 56 ° C pendant 30 min, puis chauffé à 100 ° C pendant 10 min. Après chauffage, le surnageant a été utilisé pour la PCR. La PCR a été réalisée en mélangeant 1 µL d’ADN modèle avec 20 µL de solution réactionnelle de PCR. Amorces 27F/1492R (27F: 5’ – AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: 5’ – TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) ont été utilisés pour l’amplification, puis 35 cycles d’amplification ont été effectués à 94 ° C pendant 45 sec, 55 ° C pendant 60 sec et 72 ° C pendant 60 sec. Des amorces de PCR non incorporées et des DNTP ont été retirés des produits de PCR par Montage PCR Clean up kit (Millipore). Les produits de PCR purifiés d’environ 1400 pb ont été séquencés par des amorces 518F/800R (518F: 5′-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3′, 800R: 5′-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Le séquençage a été effectué à l’aide du kit de séquençage du cycle de terminaison Big Dye v.3.1 (Applied BioSystems, États-Unis). Les produits de séquençage ont été résolus sur un système de séquençage automatisé de l’ADN modèle 3730XL d’Applied Biosystems (Applied BioSystems, États-Unis) chez Macrogen, Inc., Séoul, Corée.

Les séquences ont été analysées et comparées à la base de données publique sur les nucléotides à l’aide du site web NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Les séquences des parents les plus proches ont ensuite été extraites de la base de données et utilisées pour construire un arbre phylogénétique à l’aide de MEGA5 (Tamura et al., 2011). Contenu GC les séquences ont été calculées par Oligo Calculator (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

RÉSULTATS

Propriétés physico-chimiques des échantillons : Les échantillons d’eau de la mer Morte étaient très salins allant de (36-38%). Les valeurs de pH des échantillons étaient faibles et allaient de 5,6 à 6,3. Cela indique la propriété légèrement acide de l’eau de mer. Les valeurs de DBO étaient très faibles (1-2 mg O2 L-1), ce qui indique une très faible teneur en matières organiques dans l’échantillon. Les propriétés physico-chimiques sont présentées dans le tableau 2.

Nombre de bactéries viables hétérotrophes: Les résultats du nombre de plaques viables ont révélé un très faible nombre d’unités formant des colonies dans chaque échantillon (200-6000 UFC mL-1). Le nombre d’UFC est présenté plus en détail dans le tableau 3.

Isolement et classification des bactéries hétérotrophes halophiles: Dans cette étude, nous avons isolé 44 souches bactériennes hétérotrophes halophiles. Onze souches de bactéries sur 44 ont été considérées différentes en fonction de la morphologie coloniale, de la coloration de Gram et de la morphologie cellulaire. Sept souches différentes sur onze étaient à Gram positif et 4 sur 7 étaient à Gram négatif. Les souches bactériennes ont été identifiées sur la base d’une analyse du gène de l’ARNr 16S et elles appartiennent au domaine des bactéries. Le parent le plus proche de chaque souche bactérienne isolée est représenté dans le tableau 4 et la Fig. 2. Toutes les séquences ont montré une teneur en GC relativement élevée (jusqu’à 58%).

DISCUSSION

Les propriétés physico-chimiques des échantillons d’eau de la mer Morte ont été déterminées et analysées. Le pourcentage de salinité s’est avéré très élevé (jusqu’à 38%). C’est une caractéristique typique de l’eau de la mer Morte qui en fait l’une des célèbres saumures “athalassohaline” (Oren, 2007). Le pH de l’eau de la mer morte est légèrement acide (5,6-6,3) par rapport au pH (7,5-8) des saumures thalassohalines (Oren, 2007). La DBO des échantillons était très faible (1-2 mg O2 L-1) reflétant une faible teneur en matière organique dans l’eau pouvant être utilisée par des bactéries hétérotrophes. Ces conditions physico-chimiques affectent sans aucun doute négativement la diversité microbienne. Par conséquent, le nombre de cellules viables dans les échantillons testés était très faible (pas plus de 6×102 UFC mL-1) par rapport à l’eau de mer ouverte. Les dénombrements de bactéries hétérotrophes dans les eaux marines sont généralement de l’ordre de 105 à 106 bactéries mL-1 (Zweifel et Hagstrom, 1995; Madigan et Martinko, 2006). Ces nombres sont dérivés de techniques de coloration fluorescente non spécifiques (Zweifel et Hagstrom, 1995) qui donnent généralement des nombres plus élevés que la méthode de comptage de plaques viable. Les premières publications sur le dénombrement bactérien en mer morte ont été faites par microscopie. Le numéro de cellule était d’environ 1.9×106 cellules mL1 et lors d’une floraison d’halobactéries rouges, les densités de population ont atteint 1,9×107, mais ont diminué après les papillons jusqu’à 5×106 (Oren, 1983).

La recherche sur les organismes halophiles habitant la mer Morte a commencé très tôt en 1892 lorsque des bactéries du genre Clostridium ont été isolées de boue (Oren, 2002). Plus tard, dans un court article publié en 1936, a donné la première description d’une communauté microbienne indigène adaptée aux conditions extrêmement difficiles de la mer Morte (Oren et Ventosa, 1999). Depuis lors, nos connaissances sur les aspects biologiques de la mer Morte se développent et s’accumulent. Nous avons mené cette recherche pour élargir nos connaissances sur les bactéries hétérotrophes halophiles florissantes dans la zone littorale de la mer Morte jordanienne. Nous avons isolé différentes espèces bactériennes. Par la suite, nous avons isolé et identifié 11 espèces différentes de bactéries halophiles. La plupart des isolats étaient à Gram positif (7 sur 11). Même si les bactéries à Gram positif possèdent des adaptations importantes, elles peuvent résister à un stress environnemental tel qu’une salinité élevée (Battistuzzi et Hedges, 2009). Il n’est pas clair dans la littérature si les bactéries à Gram positif ou à Gram négatif sont dominantes dans les environnements hypersalins. Dans une étude sur des halophiles procaryotes récupérés dans des sédiments du lac salé peu profond d’El-Djerid en Tunisie, Hedi et al. (2009) ont constaté que la population bactérienne dominante appartient aux bactéries formant des spores à Gram positif.

Toutes les souches isolées dans cette étude appartiennent au domaine des bactéries. Ils appartiennent à 7 genres différents du domaine. Cinq isolats bactériens à Gram positif sur sept appartiennent au genre Bacillus. Ce genre a été créé en 1872 pour inclure trois espèces, mais il y a maintenant 142 espèces de bacilles nommées répertoriées dans le Manuel de bactériologie systématique de Bergey (Logan et de Vos, 2009). Les souches de bacilles sont généralement des souches de sol. Les souches de bacilles isolées dans cette étude appartiennent aux espèces suivantes : B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis et B. cereus. Ces souches ont été rencontrées dans différents environnements salés (Miranda et al., 2008; Parvathi et coll., 2009; Yoon et coll., 2004; Al-ZaZaee et coll., 2011). Par exemple, B. licheniformis a déjà été récupéré des sédiments marins par Miranda et al. (2008), tandis que B. pumilus a été isolé d’organismes marins comme les huîtres, le crabe et le poisson en plus des sédiments par Parvathi et al. (2009). B. hwajinpoensis a été récupéré dans l’eau de mer de la mer de l’Est et de la mer Jaune en Corée (Yoon et al., 2004). Et enfin B. cereus, une bactérie commune du sol, a été rencontrée dans les eaux usées mais avec des propriétés halophiles (Al-ZaZaee et al., 2011). Une paroi cellulaire épaisse, une teneur élevée en peptidoglycanes (plus de 90% de la paroi cellulaire) (Madigan et Martinko, 2006), une teneur élevée en GC et la formation de spores résistantes sont les principales raisons de la survie des bacilles dans des conditions difficiles comme une salinité élevée. Il est à noter que la souche DSD32 (identifiée comme B. cereus) présente une très faible similitude avec son plus proche parent B. cereus. Cette souche pourrait représenter une nouvelle espèce du genre Bacillus basée sur le gène de l’ARNr 16S.

Les deux autres bactéries à Gram positif sont des souches d’Arthrobacter sp. et Kocuria rosea. Les espèces d’Arthrobacter sont largement distribuées dans la nature, en particulier dans le sol (Funke et al., 1996) mais n’est pas très commun dans les environnements hypersalins. Kocuria rosea est considérée comme une espèce modérément halophile et elle a été récupérée dans différents environnements salins comme les eaux salines ouvertes et peu profondes et certaines souches de Kocuria rosea poussent de manière optimale à une concentration de NaCl de 30% (Wright et Tanaka, 2002).

Les bactéries à Gram négatif étaient moins fréquentes dans nos échantillons (4 sur 11). Néanmoins, la littérature publiée montre que ces isolats ne sont pas rares dans les environnements salés. L’une des souches isolées a été identifiée comme Vibrio alginolyticus. Cette dernière espèce est en fait commune dans les échantillons marins (Molitoris et al., 1985) et a été rencontré dans l’eau de mer marine. La souche a une importance médicale car elle peut provoquer une infection compliquée de la peau et des tissus mous (Sganga et al., 2009). Plus important encore, il a été constaté que certaines souches de Vibrio alginolyticus produisaient de la tétrodotoxine, une neurotoxine puissante (Noguchi et al., 1987). Une autre bactérie à Gram négatif identifiée dans cette étude est Chromohalobacter salexigens. Cette espèce a d’abord été isolée et décrite comme l’espèce modérément halophile Halomonas elongata, puis proposée comme nouvelle espèce de Chromohalobacter (Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli est une autre espèce identifiée dans cette étude. Cette souche n’est pas rare non plus pour les habitats salins. Il a été récemment isolé du plat de marée de la mer jaune en Corée et il a été décrit comme une espèce halophile par Yoon et al. (2005). La dernière souche appartient à Salinivibrio costicola. Cette espèce a d’abord été décrite sous le nom de Vibrio costicola, mais ses caractéristiques phénotypiques et génotypiques la distinguent des espèces du genre Vibrio. Par conséquent, la souche a été placée dans un nouveau genre distinct nommé Salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola est modérément halophile et a été isolé à l’origine d’aliments salés et pousse de manière optimale dans des milieux contenant 10% de sels (Mellado et al., 1996). Un membre du genre Salinibacter, S. ruber, est un modèle intéressant pour l’étude de l’adaptation des microorganismes à la vie à des concentrations élevées de sel (Oren, 2007).

CONCLUSION

L’eau de la mer Morte de la zone littorale est caractérisée par une salinité élevée, un pH faible, une faible teneur en matières organiques (DBO faible) et retient différentes espèces de bactéries hétérotrophes appartenant à des genres à Gram positif et à Gram négatif, notamment Arthrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacille et Érythrobacter.

RECONNAISSANCE

Cette étude a été soutenue par le décanat de la recherche académique de l’Université Al al-Bayt, en Jordanie, décision du Conseil de la Recherche scientifique lors de la réunion numéro 2/2010/2011. Ainsi, l’auteur aimerait apprécier l’aide financière fournie par l’Université.