Système de conception et d’étude expérimentales

En 2012, 300 graines de Brassica rapa à cycle rapide (Graine standard de Wisconsin Fast Plants, à forte variation génétique) ont été obtenues à partir de fournitures biologiques de Caroline et cultivées dans un phytotron dans des conditions normalisées de sol, de lumière et d’arrosage. Ces plantes sont entièrement croisées (auto-incompatibles) et présentent suffisamment de variation génétique sur pied pour répondre facilement à la sélection58,59. Parmi ces 300 plantes, 108 familles de graines de sib complètes ont été générées par des croisements artificiels (seules les familles de graines provenant de croisements où les deux parents produisaient des fruits ont été utilisées). Ces 108 familles complètes de graines de sib ont été utilisées comme population de départ pour l’expérience.

Pour la première génération de l’expérience, trois groupes de traitement ont été établis en utilisant les 108 familles de sorte que chaque famille soit représentée dans chaque traitement pour contrôler le génotype parmi les traitements (Fig. supplémentaire. 1). Chaque traitement comprenait donc 108 plantes (représentant 108 familles de graines), que nous avons subdivisées en trois répliques (A, B, C) contenant chacune 36 plantes. Les répliques dans les traitements ont été conservées comme lignées isolées pendant 9 générations (aucun croisement entre les répliques n’a été effectué) pour pouvoir évaluer des changements évolutifs indépendants et reproductibles. Les plantes de tous les réplicats dans tous les traitements ont été cultivées dans le phytotron dans des conditions de sol standardisé (Einheitserde classic), de lumière (lumière 24 h) et d’arrosage. Toutes les plantes ont été phénotypées toutes les deux générations à partir de la génération 1. Les données sur le parfum floral des générations 1 et 3 ont été perdues en raison de problèmes techniques; au lieu de cela, le parfum a été collecté à partir de la génération 4. Les données sur le parfum floral de la génération 1 ont été obtenues après la fin de l’expérience en repoussant les plantes de la génération de départ et en collectant le parfum d’une plante de chacune des 108 familles de graines. Ainsi, de la première génération au total, 108 plantes (36 de chaque réplication) ont été échantillonnées pour l’odeur florale en même temps que les plantes de la génération 9.

Traitements expérimentaux d’évolution et de pollinisation

Dans notre étude, nous avons utilisé trois traitements pollinisateurs: les bourdons (‘BB’, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Suisse), les mouches à mouche (‘HF’, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Allemagne) et la pollinisation manuelle. Les deux insectes visitent facilement les fleurs de nombreuses espèces de Brassicacées dans la nature, mais représentent différentes catégories de pollinisateurs fonctionnels et leur abondance varie selon les habitats naturels46. L’utilisation d’espèces de pollinisateurs uniques imite les environnements de pollinisateurs dans lesquels les pollinisateurs les plus abondants sont fonctionnellement différents. Dans le traitement témoin ( » CO « ), des plantes choisies au hasard ont été pollinisées à la main.

La pollinisation a été réalisée 23 jours après l’ensemencement dans une cage de vol (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) en serre dans des conditions de lumière normalisées avec des bourdons et des mouches à mouche. Les expériences ont été réalisées entre 0900 heures et 1500 heures. Les bourdons étaient détenus dans une cage de vol séparée dans la serre. Les mouches volantes ont été achetées comme nymphes et élevées jusqu’à l’éclosion, après quoi les mouches mâles et femelles ont été séparées. Les pollinisateurs ont été autorisés à se nourrir sur des plantes à cycle rapide de B. rapa (plantes du groupe témoin de la génération respective) et nourris avec du pollen supplémentaire jusqu’à 3 jours avant le traitement de pollinisation; ensuite, seuls le pollen et la solution de sucre ont été fournis; 16 h. avant la pollinisation, les pollinisateurs étaient affamés.

Pour la pollinisation, toutes les plantes d’une réplique ont été placées au hasard dans un carré de 6 × 6 plantes à une distance de 20 cm les unes des autres dans la cage de vol. Cinq pollinisateurs ont été ajoutés individuellement et séquentiellement et chaque insecte a été autorisé à visiter un maximum de trois plantes différentes, puis retiré de la cage; chaque insecte n’a été utilisé qu’une seule fois. Au total, 12 à 15 plantes par réplication ont reçu une ou plusieurs visites de pollinisateurs. Le nombre moyen global (±d.s.) de visites (chez les plantes visitées) était de 1,35 ±0,63 pour les plantes pollinisées par les bourdons et de 1,28±0,53 pour les plantes pollinisées par les mouches. Pour les plantes visitées, le nombre de visites et le nombre de fleurs visitées ont été enregistrés. Dans le groupe témoin, 12 plantes ont été choisies au hasard par réplication et 5 fleurs de chaque plante ont été pollinisées à la main par une plante mère choisie au hasard; les pères ont été choisis parmi les mêmes 12 plantes. Chaque plante pouvait être donneuse de pollen à plus d’une plante, mais ne recevait que du pollen d’une plante. Après la pollinisation, les fleurs visitées ont été marquées et les plantes ont été conservées dans une cage pendant 30 jours supplémentaires jusqu’à ce que les fruits soient récoltés. Les graines ont été comptées et l’ensemble de graines relatif a été calculé pour chaque plante en divisant l’ensemble de graines individuel par l’ensemble de graines moyen dans la réplique. De plus, le nombre de graines par fruit a été calculé pour chaque plante visitée. Pour chaque plante, la condition physique des mâles a été estimée en fonction de la paternité prévue (nombre d’événements d’exportation de pollen).

À partir de toutes les graines produites par les fleurs pollinisées, un sous-ensemble de graines représentatif de la production de graines de chaque individu a été utilisé pour faire pousser la génération suivante. Plus une plante produisait de graines, plus elle contribuait à la génération suivante, qui comprenait à nouveau 36 plantes pour chaque réplication. La contribution semencière de chaque plante visitée à la génération suivante a été calculée pour chaque réplication comme suit :: 36 / (répliquer la somme des graines / ensemble de graines individuel). Les valeurs inférieures à 0,5 ont été arrondies à 1.

Dépression de consanguinité

La dépression de consanguinité tout au long de l’expérience a été quantifiée en mesurant le poids des graines et le taux de germination, ce dernier en pourcentage de graines germées par réplication. De contrôle pour trait-les changements dus à la dépression de consanguinité, de graines produites par les plantes de la 9ème génération ont été cultivées (représentant de la 10e génération) et manuellement croisés entre les répétitions dans les traitements, de sorte que les plantes de chaque répétition ont été donneur de pollen et de pollen destinataire pour les plantes de deux répétitions (♀A-♂C, ♀B-♂Un, ♀C-♂B). Les croisements au sein de ces combinaisons de répliques étaient aléatoires. Parmi les graines résultantes (la onzième génération), un individu par famille de graines a été cultivé (36 plantes par réplication) dans les mêmes conditions que lors de l’expérience. Parmi ces croisements inter-répliqués, les caractères ont de nouveau été mesurés et utilisés pour la comparaison finale des caractères entre les groupes de traitement.

Caractéristiques des plantes

La plupart des caractéristiques, y compris l’odeur florale, ont été mesurées avant la pollinisation, 19 à 21 jours après le semis. La largeur des pétales, la longueur, la longueur du pistil et le diamètre des fleurs de trois fleurs choisies au hasard par plante ont été mesurés avec un étrier électronique (étrier numérique 0-150 mm, TOOLCRAFT). Le nectar de trois fleurs a été recueilli avec des micro-tubes capillaires de 1 µl (Blaubrand, Wertheim, Allemagne) et le volume déterminé en mesurant la longueur de la colonne de nectar dans la micropipette avec un étrier. Pour la quantification, la moyenne de trois fleurs a été utilisée. Pour 157 plantes réparties uniformément entre les traitements, la teneur en sucre du nectar a été déterminée par dérivatisation et analyse chromatographique en phase gazeuse. Pour ce faire, le nectar a été transmis au papier filtre stocké dans du gel de silice. Le secteur sur le papier filtre contenant le nectar a été coupé du reste du papier filtre et le nectar a été élué dans 1 ml d’eau Mili-Q de haute pureté en agitant la dilution pendant 90 min à 400 tr/min à 60 °C sur un agitateur de laboratoire. Ensuite, 50 µl de la solution ont été séchés à 60 °C et dérivatisés avec 100 µl d’un mélange de pyridine anhydre (Fisher Scientific, Geel, Belgique), d’hexaméthylsilazane (Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse) et de triméthylchlorosilane (Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse) (10:5:3). Par la suite, les échantillons ont été exécutés par GC–MS comme décrit dans la réf. 32. Nous avons calculé les quantités totales de sucre par fleur et inflorescence comme la somme de tous les sucres différents (fructose, glucose, saccharose et sorbitol). La corrélation entre la teneur en sucre de nectar et le volume de nectar était positive et élevée (r156 = 0,732, P < 0,001), ainsi, pour les plantes restantes, seul le volume de nectar a été déterminé. La collecte des parfums floraux a été effectuée avant les essais biologiques de manière non destructive à partir de toutes les inflorescences de plantes dès qu’au moins cinq fleurs étaient ouvertes. Nous avons utilisé la sorption d’espace de tête avec un système push-pull59,60. Les inflorescences des plantes étaient enfermées dans des cylindres de verre préalablement recouverts de sigmacote (Sigma-Aldrich) et fermées par une plaque de téflon. Le nombre de fleurs ouvertes a été compté pour chaque plante. L’air de l’environnement a été poussé avec un débit de 100 ml min−1 à travers des filtres à charbon actif dans le cylindre en verre. Simultanément, de l’air a été extrait du cylindre de verre avec un débit de 150 ml min−1 à travers un tube de verre rempli de Ten30 mg Tenax TA (maille 60/80; Supleco, Bellefonte, PA, USA). L’air des bouteilles de verre vides a été recueilli sous forme de commandes d’air. Les volatiles floraux ont été collectés pendant deux heures dans un phytotron dans des conditions normalisées de lumière et de température. La quantification des substances volatiles a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse avec détection sélective de masse (GC-MSD). Des échantillons ont été injectés dans un GC (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) par un échantillonneur polyvalent (MPS; Gerstel, Müllheim, Allemagne) utilisant une unité de désorption thermique Gerstel (TDU; Gerstel) avec un système d’injection à froid (CIS; Gerstel). Pour la thermodésorption, le TDU a été chauffé de 30 à 240 ° C à une vitesse de 60 ° C min-1 et maintenu à une température finale pendant 1 min. Le CIS a été réglé à -150 °C pendant le piégeage des composés élutants de la TDU. Pour l’injection, le CIS a été chauffé à 250 ° C à une vitesse de 12 ° C s-1 et la température finale a été maintenue pendant 3 min. Le GC était équipé d’une colonne HP-5 (diamètre de 0,25 mm, épaisseur de film de 0,25 µm, longueur de 15 m) et de l’hélium était utilisé comme gaz vecteur à un débit de 2 ml min−1. L’identification et la quantification des composés ont été effectuées à la suite60 avec le programme ChemStation Agilent MSD. La quantification des composés a été obtenue en mesurant les zones de crête d’ions cibles sélectionnés spécifiques aux composés odorants individuels. Des ions cibles spécifiques ont été obtenus à partir d’étalons synthétiques de tous les composés; les zones de crête ont été converties en quantités absolues à l’aide de courbes d’étalonnage précédemment obtenues pour chaque composé à l’aide de composés synthétiques à trois concentrations différentes. Seuls les composés odorants qui étaient présents en quantités significativement plus élevées que dans le contrôle de l’air ont été inclus dans l’analyse (au total 14 composés odorants). Toutes les quantités de substances volatiles ont été calculées en pg par fleur l-1 d’air échantillonné.

Vingt-trois jours après le semis, le jour même de la pollinisation, le nombre de fleurs ouvertes et la hauteur de chaque plante ont été enregistrés. Après la pollinisation (mais le même jour), les spectres de réflectance de la couleur de trois pétales de différentes fleurs non pollinisées (si possible) par plante ont été enregistrés à l’aide d’un spectrophotomètre à fibres optiques (AvaSpec-2048; Avantes, Apeldoorn, Pays-Bas) et une source de lumière pulsée au xénon (AvaLight-XE; Avantes). Un pétale à la fois a été placé sous le spectrophotomètre (en se concentrant spécifiquement sur la partie distale du pétale) et le pourcentage de réflectance (par rapport à un étalon blanc) entre 200 et 900 nm tous les 0,6 nm a été enregistré en mode transmission. Sur le spectre mesuré, seule la moyenne des valeurs de réflectance tous les 10 nm de 260 à 650 nm à partir des trois pétales a été utilisée dans l’analyse. Chez les plantes de la onzième génération, un sous-ensemble d’environ 20 plantes par réplication a été analysé pour la couleur, car aucun des PC de couleur n’a été sélectionné tout au long de l’expérience. L’aire de la surface des pétales absorbant et réfléchissant les ultraviolets a été mesurée uniquement dans l’usine de génération 11 avec un appareil photo numérique sensible aux ultraviolets avec lentille à quartz. Des photos de fleurs ont été prises et la surface absorbant les ultraviolets quantifiée à l’aide du progiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Essais des préférences des pollinisateurs

Des essais des préférences des pollinisateurs ont été effectués pour chaque réplication avec les deux types de pollinisateurs. Pour chaque réplication, deux tests comportementaux ont été effectués (un pour chaque traitement par pollinisateur). Les plantes pollinisées par les bourdons et les mouches (génération 11) de chaque réplication ont été appariées au hasard et placées côte à côte (distance d’environ 30 cm) dans une cage de vol (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m). Un pollinisateur a été placé dans la cage et autorisé à visiter une plante. Les pollinisateurs ont été immédiatement capturés après avoir fait leur choix. Chaque paire de plantes a été dosée avec un pollinisateur.

Auto-compatibilité et autofinancement autonome

Pour tester l’auto-compatibilité, nous avons cultivé des plantes de la première génération (15 plantes par réplication) et de la onzième génération (30 plantes par réplication). Une graine par famille de graines (de familles choisies au hasard) a été cultivée et deux fleurs par plante auto-cultivées à l’anthèse. Le nombre moyen de graines produites par fleur autogérée pour chaque plante individuelle a été utilisé comme mesure de l’auto-compatibilité.

Pour tester l’autofinancement autonome, nous avons cultivé environ 12 plants (une graine par famille) par réplication à partir de chaque traitement des générations 11 et 1 (au total 162 plants). Après 30 jours d’ouverture de 20 fleurs environ, les bourgeons restants de chaque plante ont été soigneusement coupés et le nombre de fleurs ouvertes a été enregistré. La plante a ensuite été autorisée à développer des fruits sans qu’aucun insecte n’accède aux plantes. Après la maturation des fruits, les graines ont été récoltées et le nombre de graines a été compté et pesé pour chaque plante. Le nombre de fruits par fleur ouverte et de graines par fruit a été utilisé comme mesure pour l’autofinancement autonome. Parce que quelques plantes avaient un nombre très élevé de fruits par fleurs ouvertes, nous avons supprimé ces valeurs aberrantes pour la comparaison finale de l’autoflagellation autonome. Le nombre de valeurs aberrantes suivantes a été supprimé : 1 en génération 1; en G11 : 2 en BB, 3 en HF, 2 en CO.

Analyse statistique

Pour analyser la sélection phénotypique, les différentiels de sélection et les gradients ont été calculés en régressant l’aptitude des plantes sur les traits61. Cette analyse a été effectuée séparément pour les traitements, mais pour toutes les répliques et générations combinées. Comme estimation de la condition physique, le « nombre de visites » a été utilisé, qui était une variable de comptage et suivait une distribution de Poisson. Une autre variable d’aptitude physique, « l’ensemble de graines relatif » avait une distibution biaisée par les nombreuses valeurs nulles; de plus, l’ensemble de graines a manqué la seule composante d’aptitude physique masculine de la première plante visitée, qui n’a pas mis de graines de cette visite (parce que les pollinisateurs ne transportaient initialement pas de pollen de Brassica). Le nombre de visites était cependant fortement corrélé avec l’ensemble de semences relatif (BB: r626 = 0,694, P < 0,001; HF: r605 = 0,597, P < 0,001). Des modèles linéaires généralisés (avec distribution de Poisson) ont été utilisés pour calculer les gradients de sélection (multivariés) et les différentiels (univariés) pour chaque traitement avec le nombre de visites comme variable dépendante et les traits comme covariables. De plus, des gradients de sélection quadratiques ont été calculés avec tous les traits et le terme carré de chaque trait ajouté au modèle, puis des gradients doublés62. Afin de vérifier les différences de sélection entre les bourdons et les voltigeurs, un modèle linéaire généralisé (avec distribution de poisson) avec le nombre de visites comme variable dépendante, le traitement comme facteur fixe, les traits des plantes comme covariables et le traitement d’interaction * trait des plantes a été réalisé. Avant l’analyse de sélection, toutes les variables ont été normalisées pour obtenir la moyenne = 0 et la d.s. = 1 (valeurs Z) au niveau de la répétition. Un modèle linéaire généralisé a également été utilisé pour comparer les taux de visite entre les plantes pollinisées par les bourdons et les mouches à mouche sur toutes les générations. Les valeurs du spectrophotomètre de couleur florale ont été réduites grâce à une analyse en composantes principales (PC) avec rotation varimax. Seuls les PC dont la valeur propre est supérieure à une ont été utilisés dans l’analyse.

Le changement évolutif des traits des plantes a été évalué chez les plantes de la 11e génération à l’aide d’une analyse de fonction discriminante linéaire multivariée et de modèles linéaires généraux univariés (GLM). Pour la GLM, chaque trait a été utilisé comme variable dépendante, reproduit comme facteur aléatoire et traité comme facteur fixe avec le test post-hoc du LSD. Pour distinguer l’impact de la sélection naturelle de la dérive, nous avons évalué si les différences de caractères étaient cohérentes entre les répliques d’un traitement de pollinisation donné. Dans l’analyse GLM, un effet de « traitement » significatif indique une différence de trait entre les différents groupes de pollinisateurs pour tous les réplicats, et distingue ainsi l’évolution spécifique du pollinisateur de la dérive. La dérive serait indiquée par des changements évolutifs dans certaines répliques (aléatoires) seulement, indiqués par une signification dans le facteur « réplication » ou l’interaction entre « réplication » et « traitement ». L’auto-compatibilité et l’autofinancement autonome ont également été évalués par GLM, mais les valeurs des plantes de première génération ont été incluses dans l’analyse. Pour les analyses des substances volatiles et du volume de nectar, les données ont été transformées en ln(1+x) pour s’approcher de la distribution normale. Pour le GLM avec les variables de couleur, une analyse PC a été effectuée comme décrit ci-dessus, mais sans standardisation préalable des variables. L’analyse PC a été réalisée pour tous les traitements, les répliques et toutes les générations ensemble, ce qui a donné quatre PC expliquant 96,9% de la variance totale. La fréquence des fleurs sans nectar a été analysée séparément pour chaque génération, en utilisant des modèles linéaires généralisés avec distribution bimodale, avec la « présence de nectar » (oui / non) comme variable dépendante, et le traitement et la réplication comme facteurs. Les caractères des fleurs nectarifères et sans nectar ont été comparés pour la neuvième et la onzième génération ensemble, en utilisant des modèles linéaires généraux avec le caractère comme variable dépendante, et la « présence de nectar » et le traitement comme facteurs fixes. Les préférences de premier choix des bourdons et des voltigeurs ont été analysées par test binomial (test-prop = 0,5; toutes les répliques regroupées). Les corrélations entre les caractéristiques du nectar et des plantes ont été calculées pour toutes les générations combinées en utilisant des corrélations produit-moment de Pearson avec des valeurs transformées en ln. Les statistiques ont été effectuées avec les statistiques IMB SPSS (version 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

Disponibilité des données