Diseño experimental y recolección de muestras

El experimento se estableció en 1982 en el condado de Mengcheng, provincia de Anhui, China (33° 13′ N, 116° 35′ E, 42 m de elevación) con suelo negro de concreción de cal típica. La temperatura anual es de 14,8 °C y la precipitación anual es de 872 mm. Se compararon cinco tratamientos de fertilización con rotación de cultivos de trigo y soja en un diseño de bloques completamente aleatorio con cuatro repeticiones (cada parcela tiene 70 m2) : (1) control, sin fertilización; (2) NPK, fertilizantes químicos NPK que comprenden urea (180 kg N ha-1 año-1), superfosfato (90 kg P2O5 ha−1 año−1) y cloruro de potasio (86 kg K2O ha−1 y−1); (3) NPK + WS, fertilizantes químicos NPK más 7500 kg de paja de trigo ha− 1 año−1; (4) NPK + PM, fertilizantes químicos NPK más 15.000 kg de estiércol de cerdo fresco ha−1 año−1; (5) NPK + CM, fertilizantes químicos NPK más 30.000 kg de estiércol de vaca fresco ha−1 año−1. En el tratamiento NPK + WS, toda la paja de trigo se devolvió al campo, el estiércol de cerdo en el tratamiento NPK + PM y el estiércol de vaca en el NPK + CM tenían una cantidad similar de carbono orgánico con la paja de trigo agregada. Además, estos tipos contrastantes de fertilizantes incluidos en nuestros tratamientos de fertilización tienen diferentes niveles de disponibilidad para plantas y microbios, por ejemplo, desde más lábiles (estiércol de cerdo) hasta más recalcitrantes (paja de trigo y estiércol de vaca). Utilizamos una amplia gama de tratamientos de fertilización con el objetivo de hacer que nuestros resultados sean representativos y aplicables a prácticas de manejo contrastantes.

Excavamos alrededor del grupo de trigo (que contenía de 30 a 40 plantas de trigo durante la etapa de llenado de trigo el 20 de abril de 2017) para mantener los sistemas de raíces lo más intactos posible. El suelo de la rizosfera que estaba firmemente adherido a las raíces fue cepillado. Al mismo tiempo, la capa superficial del suelo (0-15 cm de profundidad) se recolectó como suelo a granel utilizando un corer de barrena (aproximadamente a 20 cm de distancia de las plantas). El suelo recolectado se tamizó a través de una malla de 2 mm para eliminar las impurezas, como raíces y piedras. Parte del suelo se almacenó a 4 °C para análisis químicos, y el resto se almacenó a − 40 °C para extracción de ADN.

Análisis fisicoquímico del suelo

Se utilizó un medidor de pH (FE20 FiveEasy™, Mettler Toledo, Alemania) para medir el pH del suelo en una relación suelo / agua destilada de 1:5 (peso / volumen). La humedad del suelo se determinó gravimétricamente secando 5 g de suelo fresco a aproximadamente 105-108 °C para alcanzar un peso constante y luego calculando la relación de peso (agua evaporada a suelo seco). El contenido total de carbono (TC) y nitrógeno (TN) del suelo se determinó mediante combustión de suelo secado al aire utilizando un analizador CNS-2000 (LECO, St.Joseph, MI, EE. UU.), después de tamizar el suelo a través de una malla de 0,15 mm. Los contenidos totales de fósforo (TP) y potasio (TK) del suelo se extrajeron después de la digestión de HF-HClO4 y se midieron utilizando el método azul de molibdeno y el método de espectrofotometría de llama (FP640, INASA, China), respectivamente. El carbono orgánico disuelto (COD) se extrajo añadiendo 50 ml de agua destilada a 5 g de suelo fresco, agitando durante 1 h y filtrando al vacío a través de un filtro de fibra de vidrio G4 con un espacio de poros de 1,2 µm (Fisher), y luego, el contenido de carbono en los extractos se determinó mediante un analizador de carbono orgánico total (multi N/C 3000, Analytik Jena, Alemania). Se extrajeron nitrato (NO3 N N), amonio (NH4+-N) y nitrógeno total disuelto (DTN) en una proporción de 5 g de suelo fresco por 50 mL 2 M KCl. Después de 1 h, los extractos se filtraron a través de un filtro de fibra de vidrio G4 con un espacio de poros de 1,2 µm (Fisher), y luego se utilizó un sistema analítico de flujo continuo (sistema San++, Skalar, Holanda) para analizar el contenido de NO3 N N, NH4+-N y DTN. El nitrógeno orgánico disuelto (DON) se calculó utilizando la siguiente fórmula: DON = DTN − NH4+-N − NO3 N N. El fósforo disponible (PA) en el suelo se extrajo en 0.5 M de NaHCO3 y determinado mediante el método azul de molibdeno. El potasio (AK) disponible se extrajo con acetato de amonio de 1 M y se determinó mediante fotómetro de llama (FP640, INASA, China) (Archivo adicional 3: Apéndice 1).

Determinación de las tasas de fijación de nitrógeno

El método de etiquetado 15N2 es uno de los métodos más comunes y ampliamente aplicados utilizados para medir las tasas de fijación de N. Se colocaron cinco gramos de suelo en tubos Balch de 18 × 150 mm, y el espacio de cabeza se reemplazó con aire sintético que contenía 80% de 15N2 y 20% de O2. Los controles se llenaron con gas N2 sin etiquetar y se procesaron en paralelo. Los tubos se incubaron horizontalmente en la oscuridad a temperatura ambiente durante 22 días. El átomo % 15N de las muestras de suelo se determinó utilizando un espectrómetro de masas de relación isotópica estable (Flash 2000 HT / Conflo IV / Delta V, Thermo Fisher Scientific, Alemania). Luego, calculamos la tasa de fijación de N potencial neto comparando la diferencia de 15N total en suelos que reciben 15N2 en relación con el control.

Secuenciación de alto rendimiento y análisis bioinformático

Para la extracción de ADN, 0.se utilizaron 5 g de tierra fresca con el Kit Fast DNA SPIN (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EE. UU.). Los genes nifH se amplificaron utilizando pares de cebadores nifH-F / nifH-R(5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)/(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′) . Las reacciones de PCR se realizaron en una reacción de 20 µL que contenía 4 µL de tampón de 5 × FastPfu, 2 µL de dNTPs de 2,5 mM, 0,8 µL de imprimación delantera de 5 µM, 0,8 µL de imprimación inversa de 5 µM, 0,4 µL de polimerasa de fastPfu, 10 ng de ADN patrón y agua destilada doble (ddH2O). La amplificación se realizó a 95 ° C durante 3 min, con 35 ciclos de 95 °C para 30 s, 55 °C para 30 s y 72 °C para 45 s, y extensión a 72 °C durante 10 min. Los amplificadores de PCR se purificaron con un kit de purificación de ADN en gel de Agarosa (TaKaRa Bio), y se realizaron amplificaciones de PCR triplicadas para cada muestra y se agruparon como un producto de PCR y luego se secuenciaron en la plataforma de Illumina MiSeq PE300 (Compañía Majorbio en Shanghai, China). Después de la secuenciación, se analizaron las secuencias de nucleótidos nifH utilizando la tubería QIIME-1.9.1 (http://qiime.sourceforge.net/) . En primer lugar, se eliminaron las secuencias de baja calidad (aquellas con una puntuación de calidad < 20, que contenían nucleótidos ambiguos, o que no coincidían con el cebador y el código de barras) y las secuencias restantes se convirtieron en secuencias de aminoácidos utilizando la tubería de FunGeno del Proyecto de Base de Datos Ribosomal . Se descartaron las secuencias que codificaban proteínas que no coincidían con la secuencia de proteínas nifH o que contenían codones de terminación. Las secuencias restantes se alinearon con la base de datos de genes nifH, eliminando tanto las secuencias fallidas como las quiméricas. Las secuencias restantes de alta calidad se agruparon en unidades taxonómicas operativas (UTO) con una similitud del 95% con UCLUST ejecutándose en modo de novo, y se eliminaron todas las UTO singleton.

Análisis de redes de co-ocurrencia

Construimos una red de co-ocurrencia con todas las muestras (rizosfera y suelo a granel) e identificamos los principales grupos ecológicos de UTO fuertemente asociados. Se eligieron las UTO superiores, que representan más del 80% de la abundancia relativa en la comunidad total . Se calcularon todas las correlaciones de Spearman a pares entre UTO, y se eliminaron las correlaciones con un coeficiente de Spearman inferior a 0,65 y un valor de P superior a 0,01. Esto nos permitió centrarnos solo en los OTUs que co-ocurrieron fuertemente y eran más propensos a interactuar entre sí. Los módulos principales (clústeres ecológicos) de la red se visualizaron utilizando Gephi (https://gephi.org/). La abundancia relativa de cada grupo ecológico se calculó promediando las abundancias relativas estandarizadas (puntuación z) de las especies que le pertenecían (Archivo adicional 3: Apéndice 3).

Análisis estadístico

Se utilizaron pruebas ANOVA y t por pares para comparar las variables del suelo, los taxones microbianos dominantes y la diversidad alfa microbiana entre diferentes tratamientos de fertilización (archivo adicional 3: Apéndice 1). Estas pruebas se implementaron con el programa SPSS 21. Se utilizó la prueba de mantel para analizar las correlaciones entre la comunidad diazotrófica y las propiedades fisicoquímicas (Archivo adicional 3: Apéndice 2). Esto se realizó utilizando el paquete «vegano» en R × 32 (3.2.2). Se utilizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) para encontrar diferencias significativas en las comunidades diazotróficas entre los grupos de muestreo (archivo adicional 3: Apéndice 2). El PCoA se realizó utilizando el paquete «labdsv» R × 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

Análisis filogenéticos

El gen nifH proporciona suficiente resolución filogenética en estudios ecológicos. El árbol filogenético para los 481 filotipos diazotróficos dominantes en los racimos ecológicos se construyó utilizando FastTree y se visualizó utilizando GraPhlAn . La teoría de muestreo filogenético se puede emplear analíticamente (asumiendo el muestreo aleatorio del árbol filogenético como la diversidad filogenética predicha en una comunidad local y luego comparando la diversidad filogenética observada con esas predicciones) para determinar el grado en que la comunidad diazotrófica aparece aleatoria (entre − 2 y + 2), sobre dispersa (por encima de + 2) o agrupada (por debajo de-2). La teoría de muestreo filogenético se realizó utilizando el paquete R «picante». Una ventaja de muestrear aleatoriamente el árbol filogenético regional es que se puede usar para comparar muestras de tamaños desiguales según el modelo de muestreo binomial . Las diferencias entre la diversidad filogenética observada y esperada se determinaron calculando y comparando las puntuaciones z para cada grupo ecológico. Cuando la diversidad filogenética observada es inferior a la diversidad esperada (inferior a − 2), se considera que la comunidad microbiana en el grupo ecológico está agrupada filogenéticamente, lo que significa que es más probable que los taxones estrechamente relacionados sean muestreados y seleccionados activamente por el medio ambiente .

Análisis de modelado de ecuaciones estructurales

El SEM se realizó utilizando IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation). Se utilizó para evaluar los efectos directos e indirectos de las propiedades fisicoquímicas del suelo y la abundancia relativa de los principales conglomerados ecológicos sobre las tasas de fijación de N. Las propiedades fisicoquímicas del suelo incluyeron el pH del suelo, el carbono total, el nitrógeno total y el fósforo total. En el modelo, los tratamientos (control, NPK , NPK + WS, NPK + PM y NPK + CM) fueron variables categóricas con dos niveles: 1 (un tratamiento en particular) y 0 (tratamientos restantes considerados). Además, se utilizó bootstrapping para probar la probabilidad de que los coeficientes de ruta difirieran de cero, ya que algunas de las variables no se distribuían normalmente. También calculamos los efectos totales estandarizados (STE) de las propiedades del suelo, los tratamientos de fertilización y el efecto de la rizosfera en la tasa de fijación de N para ayudar a la interpretación del MEB.

Análisis de modelado de bosques aleatorios

Regresión de Bosques aleatorios (paquete R «randomForest») se utilizó para retroceder las UTO normalizadas en diferentes tratamientos. Se utilizó el método de validación cruzada de 10 veces para determinar el conjunto óptimo de UTO correlacionado con las tasas de fijación de N. Las listas ordenadas de UTO en orden de Bosques aleatorios reportados puntajes de importancia de características se obtuvieron en función del aumento en el error cuadrado medio de las tasas de fijación de nitrógeno predichas en más de 100 iteraciones del algoritmo. Las UTO de 50 marcadores se eligieron en función de los errores de media cuadrada de validación cruzada media mínima, que se obtuvieron de cinco ensayos de validación cruzada de 10 veces.