kokeellinen suunnittelu ja näytteenotto

koe aloitettiin vuonna 1982 Mengchengin piirikunnassa, Anhuin maakunnassa, Kiinassa (33° 13′ N, 116° 35′ E, 42 m: n korkeus) tyypillisellä kalkin betonoinnilla mustassa maaperässä. Vuoden lämpötila on 14,8 °C ja vuotuinen sademäärä 872 millimetriä. Viittä lannoituskäsittelyä vehnä-soijapapu-viljelykierrolla verrattiin täysin satunnaistetussa lohkokartoituksessa neljällä rinnakkaisnäytteellä (jokainen havaintoala on 70 m2) : (1) kontrolli, ei lannoitus; (2) NPK, NPK kemialliset lannoitteet, jotka koostuvat ureasta (180 kg n ha−1 year−1), superfosfaatista (90 kg P2O5 ha−1 year−1) ja kaliumkloridista (86 kg K2O ha− 1 y−1); (3) NPK + WS, NPK kemialliset lannoitteet plus 7500 kg vehnän olkea ha−1 vuosi−1; (4) NPK + pm, NPK kemialliset lannoitteet plus 15 000 kg tuoretta sianlantaa ha−1 vuosi−1; (5) NPK + CM, NPK kemialliset lannoitteet plus 30000 kg tuoretta lehmänlantaa ha−1 vuosi−1. NPK + WS-käsittelyssä kaikki vehnän oljet palautettiin pellolle, NPK + PM-käsittelyssä sianlanta ja NPK + CM: ssä lehmänlanta sisälsi saman verran orgaanista hiiltä lisättyjen vehnänolkien kanssa. Lisäksi näiden hedelmöityshoitoihimme sisältyvien vastakkaisten lannoitteiden saatavuus kasveille ja mikrobeille vaihtelee labiilisemmasta (sianlanta) vastahakoisempaan (vehnän olki ja lehmän lanta). Käytimme monenlaisia hedelmöityshoitoja, joiden tavoitteena oli tehdä tuloksistamme edustavia ja soveltuvia vastakkaisiin hoitokäytäntöihin.

kaivoimme vehnäryhmän ympärille (sisältää 30-40 vehnäkasvia vehnän täyttövaiheessa 20.4.2017) pitääksemme juuristot mahdollisimman ehjinä. Juurista tiukasti kiinni ollut rhizosfäärin maaperä harjattiin sitten. Samalla pintamaa (0-15 cm syvä) kerättiin irtomaaksi Kairan korkilla (noin 20 cm päässä kasveista). Kerätty maa seulottiin 2 mm: n verkolla epäpuhtauksien, kuten juurien ja kivien, poistamiseksi. Osa maa − aineksesta säilytettiin 4 °C: ssa kemiallisia analyysejä varten ja loput-40 °C: ssa DNA: n erottamista varten.

maaperän fysikaalis-kemiallinen analyysi

maan pH-mittaria (FE20 FiveEasy™, Mettler Toledo, Saksa) käytettiin maan pH:n mittaamiseen siten, että maan ja tislatun veden suhde oli 1: 5 (paino / tilavuus). Maan kosteus määritettiin gravimetrisesti kuivaamalla 5 g tuoretta maa-ainesta noin 105-108 °C: n lämpötilassa vakiopainon saavuttamiseksi ja laskemalla sitten painosuhde (haihdutettu vesi kuivuneeseen maahan). Maa-aineksen kokonaishiilipitoisuus (TC) ja kokonaistyppipitoisuus (tn) määritettiin palamalla ilmakuivattua maa-ainesta CNS-2000-analysaattorilla (LECO, St. Joseph, MI, USA) sen jälkeen, kun maa-aines oli seulottu 0,15 mm: n verkolla. Maaperän kokonaisfosfori (TP) ja kokonaiskalium (tk) uutettiin HF-HClO4-digestion jälkeen ja mitattiin molybdeenisinisellä menetelmällä ja liekkispektrofotometrisella menetelmällä (FP640, Inasa, Kiina). Liuennutta orgaanista hiiltä (DOC) uutettiin lisäämällä 50 mL tislattua vettä 5 g: aan tuoretta maata, ravistamalla 1 tunnin ajan ja tyhjiösuodatuksella g4-lasikuitusuodattimen läpi, jonka huokostila on 1,2 µm (Fisher), ja sitten uutteiden hiilipitoisuus määritettiin orgaanisen hiilen kokonaisanalysaattorilla (multi N/C 3000, Analytik Jena, Saksa). Nitraattia (NO3–n), ammonium (NH4+-n) ja liuennutta kokonaistyppeä (DTN) uutettiin suhteessa 5 g tuoretta maa-ainesta suhteessa 50 mL 2 M KCl. 1 tunnin kiinnityksen jälkeen uutteet suodatettiin g4-lasikuitusuodattimen läpi, jonka huokostila on 1,2 µm (Fisher), ja sitten jatkuvatoimista analyyttistä järjestelmää (San++-järjestelmä, Skalar, Hollanti) käytettiin no3-n, NH4+ – n ja DTN: n sisällön analysointiin. Liuennut orgaaninen typpi (DON) laskettiin seuraavalla kaavalla: DON = DTN − NH4+-N − NO3–N. maaperässä oleva käytettävissä oleva fosfori (AP) erotettiin 0: lla.5 M NaHCO3 ja määritetään käyttämällä molybdeeni sininen menetelmä. Käytettävissä oleva kalium (AK) uutettiin 1 M: n ammoniumasetaatilla ja määritettiin liekki-fotometrillä (FP640, INASA, Kiina) (lisätiedosto 3: Lisäys 1).

typensitoutumisasteen määrittäminen

15n2-merkintämenetelmä on yksi yleisimmistä ja laajimmin käytetyistä menetelmistä Typensitoutumisasteen mittaamiseksi . Viisi grammaa maa-ainesta laitettiin 18 × 150 mm: n Paaluputkiin, ja päätila korvattiin synteettisellä ilmalla, jossa oli 80% 15n2: ta ja 20% O2: ta. Ohjaimet täytettiin merkitsemättömällä N2-kaasulla ja käsiteltiin rinnakkain. Putkia inkuboitiin vaakatasossa pimeässä huoneenlämmössä 22 päivän ajan. Maanäytteiden atomi % 15N määritettiin vakaan isotooppisuhteen massaspektrometrillä (Flash 2000 HT/Conflo IV/Delta V, Thermo Fisher Scientific, Saksa). Sitten laskimme nettopotentiaalin n kiinnittymisaste vertaamalla erotus yhteensä 15N maaperässä vastaanottavan 15n2 suhteessa valvonta.

Suurikapasiteettinen sekvensointi ja bioinformatiikan analyysi

DNA-uuttoa varten, 0.Fast DNA SPIN Kit: n (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA) kanssa käytettiin 5 g tuoretta multaa. NifH-geenit monistettiin käyttäen pohjuspareja nifH-F/nifH-R (5′-AAAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCACC-3′) / (5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCATCAT-3′) . PCR-reaktioita suoritettiin 20 µL: n reaktiolla, joka sisälsi 4 µL 5 × FastPfu-puskuria, 2 µL 2,5 mM dntps: ää, 0,8 µL 5 µM: n eteenpäin suuntautuvaa primeria, 0,8 µL 5 µM: n käänteistä primeria, 0,4 µL fastPfu-polymeraasia, 10 ng templaatti-DNA: ta ja kaksinkertaista tislattua vettä (ddH2O). Vahvistus suoritettiin 95 °C: ssa 3 minuutin ajan, 35 sykliä 95 °C: ssa 30 sekunnin ajan, 55 °C: ssa 30 sekunnin ajan ja 72 °C: ssa 45 sekunnin ajan ja laajennus 72 °C: ssa 10 minuutin ajan. PCR-amplikonit puhdistettiin Agarose Gel DNA purification kit-valmisteella (TaKaRa Bio), ja kolminkertainen PCR-vahvistin kullekin näytteelle suoritettiin ja yhdistettiin PCR-tuotteeksi ja sitten sekvensoitiin Illumina MiSeq PE300: n (Majorbio-yritys Shanghaissa, Kiinassa) alustalla. Sekvensoinnin jälkeen nifH-nukleotidisekvenssit analysoitiin käyttäen qiime-1.9.1-putkea (http://qiime.sourceforge.net/) . Ensinnäkin heikkolaatuiset sekvenssit (ne, joiden laatuluku < 20, jotka sisältävät monitulkintaisia nukleotideja tai jotka eivät vastaa aluketta ja viivakoodia) poistettiin ja loput sekvenssit muunnettiin edelleen aminohapposekvensseiksi ribosomaalisen Tietokantahankkeen Fungeeniputkea käyttäen . Proteiineja koodaavat sekvenssit, jotka eivät vastanneet nifh-proteiinisekvenssiä tai jotka sisälsivät päättymiskodoneja, hylättiin. Loput sekvenssit olivat linjassa nifH-geenitietokannan kanssa, poistaen sekä epäonnistuneet että kimeeriset sekvenssit. Loput korkealaatuiset sekvenssit ryhmiteltiin operatiivisiksi taksonomisiksi yksiköiksi (OTUs) 95%: n samankaltaisuudella de novo-tilassa suoritettavan UCLUSTIN kanssa, ja kaikki singleton OTUs: t poistettiin.

Rinnakkaisesiintymisverkostoanalyysi

rakensimme rinnakkaisesiintymisverkoston kaikista näytteistä (rhizosphere ja bulkkimaaperä) ja kartoitimme vahvasti toisiinsa liittyvien otusten tärkeimmät ekologiset klusterit. Ylimmät otukset, joiden osuus koko yhteisön suhteellisesta runsaudesta on yli 80%, valittiin . Otuksen kaikki pariviisaat Keihäskorrelaatiot laskettiin, ja niistä poistettiin alle 0,65: n ja yli 0,01: n P-arvon korrelaatiot. Näin pystyimme keskittymään vain otuksiin, jotka olivat vahvasti yhteistoiminnassa keskenään ja olivat todennäköisemmin vuorovaikutuksessa keskenään. Verkoston tärkeimmät moduulit (ekologiset klusterit) visualisoitiin Gefi-menetelmällä (https://gephi.org/). Kunkin ekologisen klusterin suhteellinen runsaus laskettiin keskiarvona siihen kuuluvien lajien standardoiduista suhteellisista pitoisuuksista (Z-score) (Lisätiedosto 3: Lisäys 3).

tilastollinen analyysi

ANOVA-ja pairwise-t-testejä käytettiin vertailemaan maaperän muuttujia, dominanttimikrobisia taksoneja ja alfamikrobiston monimuotoisuutta eri hedelmöityshoitojen välillä (lisätiedosto 3: Lisäys 1). Testit toteutettiin SPSS: n avulla 21. Mantel-testiä käytettiin diatsotrofisen yhteisön ja fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien välisten korrelaatioiden analysointiin (Lisätiedosto 3: Lisäys 2). Tämä tehtiin käyttämällä ”vegaani” – pakettia R × 32: ssa (3.2.2). Pääasiallisen koordinaattianalyysin (pcoa) avulla löydettiin merkittäviä eroja diatsotrofisissa yhteisöissä näytteenottoryhmien välillä (Lisätiedosto 3: Lisäys 2). PCoA: ssa käytettiin” labdsv” – pakettia R × 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

fylogeneettiset analyysit

nifh-geeni antaa ekologisissa tutkimuksissa riittävän fylogeneettisen erottelukyvyn. Fylogeneettinen puu 481 hallitsevalle diatsotrofiselle fylotyypille ekologisissa klustereissa rakennettiin Fasttreen avulla ja visualisoitiin Graphlanin avulla . Fylogeneettistä näytteenottoteoriaa voidaan käyttää analyyttisesti (olettaen, että satunnaisotanta fylogeneettisestä puusta on ennustettu fylogeneettinen monimuotoisuus paikallisyhteisössä ja vertaamalla sitten havaittua fylogeneettistä monimuotoisuutta näihin ennusteisiin) sen määrittämiseksi, missä määrin diatsotrofinen yhteisö esiintyy satunnaisena (välillä − 2 ja + 2), yli hajaantuneena (yli + 2) tai ryhmittyneenä (alle-2). Fylogeneettinen näytteenottoteoria suoritettiin käyttäen R-pakettia ”picante”. Alueellisen fylogeneettisen puun satunnaisotannan etuna on se, että sillä voidaan vertailla erikokoisia näytteitä binomisen näytteenottomallin perusteella . Erot havaitun ja odotetun fylogeneettisen monimuotoisuuden välillä määritettiin laskemalla ja vertaamalla z-pisteitä kullekin ekologiselle klusterille. Kun havaittu fylogeneettinen monimuotoisuus on pienempi kuin odotettu monimuotoisuus (alle − 2), ekologisen klusterin mikrobiyhteisö katsotaan fylogeneettisesti klusteroituneeksi, mikä tarkoittaa, että läheistä sukua olevat taksonit ovat todennäköisemmin ympäristönäytteitä ja aktiivisesti valitsemia .

Rakenneyhtälön mallinnusanalyysi

SEM tehtiin IBM SPSS Amos 21: llä (Chicago, IL: Amos Development Corporation). Sen avulla arvioitiin maaperän fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien sekä tärkeimpien ekologisten klustereiden suhteellisen runsauden suoria ja epäsuoria vaikutuksia typen kiinnittymisasteeseen. Maaperän fysikaaliskemiallisia ominaisuuksia olivat muun muassa maaperän pH, kokonaishiili, Kokonaistyppi ja kokonaisfosfori. Mallissa hoidot (kontrolli, NPK, NPK + WS, NPK + PM ja NPK + CM) olivat kategorisia muuttujia, joilla oli kaksi tasoa: 1 (tietty hoito) ja 0 (Muut harkitut hoidot). Lisäksi bootstrappingilla testattiin todennäköisyyttä sille, että polkukertoimet poikkesivat nollasta, koska osa muuttujista ei normaalisti jakautunut. Laskimme myös maaperän ominaisuuksien, lannoitushoitojen ja rhizosphere-vaikutuksen standardoidut kokonaisvaikutukset (STEs) N kiinnittymisasteeseen sem: n tulkinnan helpottamiseksi.

Random Forest modeling analysis

Random Forest regression (R-paketti ”randomForest”) avulla normalisoitua otusta palautettiin eri käsittelyissä. 10-kertaista ristivalidointimenetelmää käytettiin määritettäessä otus-järjestelmän optimaalista joukkoa, joka korreloi N: n kiinnitysasteeseen . Pisteytetyt OTUs – listat Satunnaismetsien raportoitujen ominaisuuksien tärkeysjärjestyksessä saavutettiin perustuen typensitoutumisasteen keskiarvon neliövirheen kasvuun, joka ennustettiin algoritmin yli 100 iteraation aikana. 50 merkkiainetta OTUs valittiin ristivalidoinnin keskiarvon neliövirheiden perusteella, jotka saatiin viidestä 10-kertaisen ristivalidoinnin kokeesta.