Experimental design and study system

vuonna 2012 300 fast cycling Brassica rapa plants-kasvin siementä (Wisconsin Fast Plants Standard Seed, jossa on suuri geneettinen vaihtelu) saatiin Carolinan biologisista tarvikkeista ja kasvatettiin fytotronissa standardoiduissa maaperä -, valo-ja kasteluolosuhteissa. Nämä kasvit ovat täysin ulkosiittoisia (itse yhteensopimattomia) ja niissä on riittävästi pysyvää geneettistä vaihtelua,jotta ne voivat helposti reagoida valintaan58, 59. Näistä 300 kasvista 108 täyttä sib-siemensukua syntyi keinotekoisilla risteytyksillä (käytettiin vain siemensukuja risteytyksistä, joissa molemmat vanhemmat tuottivat hedelmiä). Kokeilun aloituspopulaationa käytettiin näitä 108 täyttä sib-siemensukua.

ensimmäisen sukupolven kokeessa muodostettiin kolme hoitoryhmää käyttäen 108 perhettä niin, että jokainen perhe oli edustettuna kussakin hoidossa genotyypin kontrolloimiseksi hoitojen kesken (täydentävä Kuva. 1). Jokainen käsittely koostui siis 108 kasvista (jotka edustivat 108 siemensukua), jotka jaoimme kolmeen toisintoon (A,B,C), joissa kussakin oli 36 kasvia. Käsittelyissä otetut rinnakkaisnäytteet säilytettiin eristettyinä linjoina 9 sukupolven ajan (rinnakkaisnäytteiden välillä ei tehty risteytyksiä), jotta voitiin arvioida itsenäisiä, toistettavissa olevia evoluutiomuutoksia. Kaikissa käsittelyissä kaikkien rinnakkaisnäytteiden kasvit kasvatettiin fytotronissa standardoidussa maaperässä (Einheitserde classic), valossa (24 h valo) ja kastelu-olosuhteissa. Kaikki kasvit fenotyypitettiin joka toinen sukupolvi alkaen sukupolvesta 1. Kukkaistuoksutiedot sukupolvelta 1 ja 3 katosivat teknisten ongelmien vuoksi, sen sijaan tuoksut kerättiin sukupolvesta 4. Sukupolven 1 kukkaistuoksutiedot saatiin kokeen päätyttyä kasvattamalla uudelleen aloittavan sukupolven kasveja ja keräämällä tuoksuja yhdestä kasvista jokaisesta 108 siemensuvusta. Niinpä ensimmäisestä sukupolvesta otettiin kaikkiaan 108 kasvia (36 jokaisesta rinnakkaisnäytteestä) kukkaistuoksun saamiseksi samaan aikaan kuin 9 sukupolven kasveista.

kokeelliset evoluutio-ja pölytyshoidot

tutkimuksessamme käytimme kolmea pölyttäjähoitoa: kimalaisia (”BB”, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Sveitsi), leijulautoja (”HF”, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Saksa) ja käsipölytystä. Molemmat hyönteiset käyvät helposti monien Brassicaceae-lajien kukissa luonnossa, mutta edustavat erilaisia funktionaalisia pölyttäjäluokkia, ja niiden on osoitettu vaihtelevan runsaasti luontaisissa elinympäristöissä46. Yksittäisten pölyttäjälajien käyttö jäljittelee pölyttäjäympäristöjä, joissa runsaimmat pölyttäjät ovat toiminnallisesti erilaisia. Kontrollikäsittelyssä satunnaisesti valitut kasvit ristipölytettiin käsin.

pölytys suoritettiin 23 päivää kylvön jälkeen kasvihuoneessa (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) lento-häkissä standardoiduissa valo-olosuhteissa kimalaisten ja leijulintujen kanssa. Kokeita tehtiin kello 09.00 – 15.00. Kimalaisia pidettiin erillisessä lentohäkissä kasvihuoneessa. Leijukärpäset hankittiin koteloiksi ja niitä kasvatettiin kuoriutumiseen asti, jonka jälkeen koiras-ja naaraskärpäset erotettiin toisistaan. Pölyttäjät saivat käyttää ravinnokseen nopeasyklisiä B. rapa-kasveja (kunkin sukupolven kontrolliryhmän kasveja), ja niitä ruokittiin ylimääräisellä siitepölyllä 3 päivää ennen pölytyskäsittelyä; sen jälkeen annettiin vain siitepölyä ja sokeriliuosta; 16 tuntia ennen pölytystä pölyttäjät näännytettiin nälkään.

pölytystä varten kaikki yhden toisinnon kasvit sijoitettiin satunnaisesti 6 × 6 kasvin neliöön, jonka etäisyys toisistaan oli 20 cm lentohäkissä. Pölyttäjiä lisättiin viisi erikseen ja peräkkäin, ja jokainen hyönteinen sai käydä korkeintaan kolmessa eri kasvissa ja sen jälkeen se poistettiin häkistä; jokaista hyönteistä käytettiin vain kerran. Yhteensä 12-15 kasvia replikaatiota kohden sai yhden tai useamman pölyttäjäkäynnin. Keskimääräinen (±S.d.) käyntimäärä (vierailluissa laitoksissa) oli kimalaispölytteisillä kasveilla 1, 35±0, 63 ja leijupölytteisillä kasveilla 1, 28±0, 53. Vierailtujen kasvien osalta kirjattiin käyntien määrä ja vierailtujen kukkien määrä. Kontrolliryhmässä valittiin satunnaisesti 12 kasvia replikaatiota kohti ja 5 kukkaa kustakin kasvista pölytti käsin yksi satunnaisesti valittu isäkasvi; isät valittiin samojen 12 kasvin joukosta. Kukin kasvi saattoi olla siitepölyn luovuttaja useammalle kuin yhdelle kasville, mutta sai siitepölyä vain yhdestä kasvista. Pölytyksen jälkeen vierailtavat Kukat merkittiin ja kasveja pidettiin häkissä vielä 30 päivää, kunnes hedelmät kerättiin. Siemenet laskettiin ja kunkin kasvin suhteellinen siemenjoukko laskettiin jakamalla yksittäinen siemenjoukko toisinnon siemenjoukon keskiarvolla. Lisäksi laskettiin siementen määrä hedelmää kohti kutakin vierailtua kasvia kohti. Kullekin kasville urosten kunto arvioitiin ennustetun isyyden mukaan (siitepölyvientitapahtumien määrä).

kaikista pölyttyneiden kukkien tuottamista siemenistä käytettiin kunkin yksilön siementuotantoa edustava siemenjoukko seuraavan sukupolven kasvattamiseen. Mitä enemmän siemeniä kasvi tuotti, sitä enemmän se edisti seuraavaa sukupolvea, joka taas koostui 36 kasvista jokaista toistoa kohti. Kunkin tarkastetun kasvin siemenosuus seuraavalle sukupolvelle laskettiin jokaisesta toistosta seuraavasti:: 36/(siementen rinnakkaissumma/yksittäinen siemenkokonaisuus). Alle 0,5: n arvot pyöristettiin 1: een.

Sisäsiittoisuuslama

sisäsiittoisuuslama koko kokeen ajan mitattiin mittaamalla siementen paino ja itävyys, jälkimmäinen prosentteina itäneistä siemenistä replikaattia kohti. Valvonta piirre-muuttaa, koska sisäsiitos masennus, siemenet tuotetaan kasveja 9. sukupolvi oli kasvanut (eli 10. sukupolvi) ja manuaalisesti ristissä välillä jäljittelee sisällä hoitoja, niin, että kasvit kunkin jäljitellä olivat siitepöly luovuttaja ja siitepölyä vastaanottaja kasveja kahden eri rinnakkaisnäytettä (♀A-♂C, ♀B-♂A, ♀C-♂B). Risteytykset näiden rinnakkaisyhdistelmien sisällä olivat satunnaisia. Tuloksena saaduista siemenistä (yhdestoista sukupolvi) kasvatettiin yksi yksilö siemenperhettä kohti (36 kasvia toistoa kohti) samoissa olosuhteissa kuin kokeen aikana. Näistä toistojen välisistä risteytyksistä ominaisuudet mitattiin uudelleen ja niitä käytettiin hoitoryhmien välisten ominaisuuksien lopulliseen vertailuun.

kasvien piirteet

useimmat piirteet, mukaan lukien kukkaistuoksu, mitattiin ennen pölytystä, 19-21 päivää kylvön jälkeen. Terälehden leveys, pituus,sikiäimen pituus ja kukan halkaisija kolme satunnaisesti valittua kukkaa kasvia kohti mitattiin elektronisella verhiöllä (digitaalinen verhiö 0-150 mm, TOOLCRAFT). Nektaria kolmesta kukasta kerättiin 1 µl: n mikro-kapillaariputkilla (Blaubrand, Wertheim, Saksa) ja tilavuus määritettiin mittaamalla medipylvään pituus mikropipulla. Määrityksessä käytettiin kolmen kukan keskiarvoa. Käsittelyissä tasaisesti jakaantuneiden 157 kasvin sokeripitoisuus määritettiin derivatisoinnin ja kaasukromatografisen analyysin avulla. Sitä varten nektari siirtyi silikageeliin varastoituun suodatinpaperiin. Nektaria sisältävän suodatinpaperin sektori leikattiin muusta suodatinpaperista ja nektari eluoitiin 1 ml: ssa erittäin puhdasta Mili-Q-vettä ravistamalla laimennosta 90 minuutin ajan 400 kierrosta minuutissa 60 °C: ssa laboratorion ravistimessa. Tämän jälkeen 50 µl liuosta kuivattiin 60 °C:ssa ja johdettiin 100 µl:lla vedettömän pyridiinin (Fisher Scientific, Geel, Belgia), heksametyylisilatsaanin (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveitsi) ja trimetyylikloorisilaanin (Sigma-Aldrich, Buchs, Sveitsi) seosta (10: 5: 3). Tämän jälkeen näytteet otettiin GC–MS: llä ref: n kuvauksen mukaisesti. 32. Laskimme sokerin kokonaismäärät kukintoa ja kukintoa kohden kaikkien eri sokerien (fruktoosi, glukoosi, sakkaroosi ja sorbitoli) summana. Korrelaatio meden sokeripitoisuuden ja meden tilavuuden välillä oli positiivinen ja korkea (r156=0,732, p<0,001), joten jäljelle jääneistä kasveista määritettiin vain meden tilavuus. Kukkaistuoksukeräys tehtiin ennen biotestejä nondestrustavasti kaikista kasvien kukinnoista heti, kun vähintään viisi kukkaa oli auki. Käytimme headspace sorptiota push-pull-järjestelmällä 59, 60. Kasvien kukinnot suljettiin lasisylintereihin, jotka oli aiemmin päällystetty sigmacotella (Sigma-Aldrich) ja suljettu Teflonlevyllä. Avonaisten kukkien määrä laskettiin kullekin kasville. Ympäröivästä ilmasta työnnettiin virtausnopeudella 100 ml min−1 kaukalo aktiivihiilisuodattimia lasisylinteriin. Samanaikaisesti vedettiin ilmaa lasisylinteristä virtausnopeudella 150 ml min−1 aallonpohjaan lasiputki, joka oli täytetty ∼30 mg Tenax TA: lla (60/80 mesh; Supleco, Bellefonte, PA, USA). Tyhjistä lasisylintereistä kerättiin ilmaa ilmansäätöiksi. Kukkien haihtuvia aineita kerättiin kaksi tuntia fytotronissa standardoiduissa valo-ja lämpötilaolosuhteissa. Haihtuvien aineiden kvantifiointi tehtiin kaasukromatografialla massaselektiivisellä detektiolla (GC-MSD). Monikäyttöinen näytteenottaja (MPS; Gerstel, Müllheim, Saksa) ruiskutti näytteet GC: hen (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) käyttäen Gerstelin lämpödesorptioyksikköä (TDU; Gerstel) ja kylmäruiskutusjärjestelmää (CIS; Gerstel). Termodesorptiota varten TDU kuumennettiin 30-240 °C nopeudella 60 °C min−1 ja pidettiin lopullisessa lämpötilassa 1 min. CIS: n lämpötila oli -150 °C TDU: n elutointiyhdisteiden pyydystämisen aikana. Injektiota varten CIS kuumennettiin 250 °C: seen nopeudella 12 °c s−1, ja lopullinen lämpötila pidettiin 3 min. GC oli varustettu HP-5-kolonnilla (halkaisija 0,25 mm, kalvon paksuus 0,25 µm, Pituus 15 m) ja heliumia käytettiin kantokaasuna virtausnopeudella 2 ml min−1. Yhdisteen tunnistaminen ja kvantifiointi tehtiin 60: n jälkeen Agilent MSD ChemStation-ohjelmalla. Yhdisteiden kvantifiointi saatiin mittaamalla yksittäisille hajuyhdisteille spesifisten kohde-ionien huippualueita. Spesifiset kohde-ionit saatiin kaikkien yhdisteiden synteettisistä standardeista; huippualueet muunnettiin absoluuttisiksi määriksi käyttäen kalibrointikäyriä, jotka oli aiemmin saatu kullekin yhdisteelle käyttämällä synteettisiä yhdisteitä kolmessa eri pitoisuudessa. Analyysiin otettiin mukaan vain tuoksuyhdisteitä, joita oli huomattavasti enemmän kuin ilmakontrollissa (yhteensä 14 tuoksuyhdistettä). Kaikki haihtuvien aineiden määrät laskettiin pg: nä kukka l-1-näytettä kohti.

kaksikymmentäkolme päivää kylvön jälkeen, samana päivänä kuin pölytys tehtiin, kirjattiin avonaisten kukkien määrä ja kunkin kasvin korkeus. Pölytyksen (mutta samana päivänä) jälkeen kirjattiin kuitupektrofotometrillä (Avapec-2048) kolmen eri pölyttämättömien (mahdollisuuksien mukaan) kukkien terälehtien väri-heijastusspektrometri kasvia kohti.; Avantes, Apeldoorn, Alankomaat) ja ksenon-pulssivalonlähde (AvaLight-XE; Avantes). Spektrofotometrin alle asetettiin yksi terälehti kerrallaan (keskittyen erityisesti terälehden distaaliseen osaan) ja heijastusprosentti (suhteessa valkoiseen standardiin) 200-900 nm joka 0,6 nm. Mitatusta spektristä analyysissä käytettiin vain kolmen terälehden heijastusarvojen keskiarvoa 10 nm: n välein 260-650 nm: n välillä. Yhdennentoista sukupolven kasveissa analysoitiin noin 20 kasvin osajoukko rinnakkaisnäytettä kohti, koska yhdenkään väri-PC: n ei havaittu olevan valittavana koko kokeen ajan. Ultraviolettia imevän ja heijastavan terälehden pinnan pinta-ala mitattiin vain sukupolven 11 kasvissa kvartsilinssillä varustetulla ultraviolettiherkällä digitaalikameralla. Kukista otettiin kuvia ja ultraviolettisäteilyä absorboiva pinta-ala kvantifioitiin ohjelmistopaketti ImageJ: n avulla ( https://imagej.nih.gov/ij/).

pölyttäjien mieltymysten määritykset

pölyttäjien mieltymysten Määritykset tehtiin kullekin rinnakkaisnäytteelle molemmilla pölyttäjätyypeillä. Kullekin rinnakkaisnäytteelle tehtiin kaksi käyttäytymiskoetta (yksi kutakin pölyttäjäkäsittelyä kohti). Kimalais – ja leijupölytteiset kasvit (sukupolvi 11) kummastakin rinnakkaisnäytteestä paritettiin satunnaisesti ja asetettiin vierekkäin (noin 30 cm: n etäisyydellä) lentohäkkiin (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m). Yksi pölyttäjä laitettiin häkkiin ja annettiin käydä yhdessä kasvissa. Pölyttäjät saatiin kiinni heti valintansa jälkeen. Jokainen kasvipari määritettiin yhdellä pölyttäjällä.

Itsesoveltuvuus ja autonominen itsesoveltuvuus

itsesoveltuvuuden testaamiseksi kasvatimme kasveja ensimmäisestä (15 kasvia replikaattia kohti) ja yhdennestätoista sukupolvesta (30 kasvia replikaatiota kohti). Yksi siemen siemensukua kohti (satunnaisesti valituista suvuista) kasvatettiin ja kaksi kukkaa kasvia kohti, jotka itse kasvatettiin anteesissa. Kunkin yksittäisen kasvin itseliikkuvaa kukkaa kohti tuotettujen siementen keskiarvoa käytettiin itseliikkuvuuden mittaamiseen.

testataksemme autonomista itsesyntymää kasvatimme noin 12 kasvia (yksi siemen per suku) jokaista jälkeläistä kohti jokaisesta sukupolven 11 ja 1 käsittelystä (yhteensä 162 kasvia). 30 päivän kuluttua, kun noin 20 kukkaa oli avautunut, kunkin kasvin jäljellä olevat silmut leikattiin huolellisesti ja avattujen kukkien määrä kirjattiin ylös. Tämän jälkeen kasvin annettiin kehittää hedelmiä ilman, että kasveihin pääsi hyönteisiä. Hedelmien kypsymisen jälkeen kerättiin siemenet ja laskettiin ja punnittiin siemenmäärä kutakin kasvia kohti. Hedelmien määrää avoimena olevaa kukkaa ja siementä kohti hedelmiä käytettiin mittarina autonomiselle selfingille. Koska muutamilla kasveilla oli erittäin suuri määrä hedelmiä avonaisia kukkia kohden, poistimme nämä poikkeamat autonomisen selfingin lopullista vertailua varten. Seuraavat poikkeamat poistettiin: 1 sukupolvesta 1; G11: 2 BB: ssä, 3 HF: ssä, 2 CO: ssa.

tilastollinen analyysi

fenotyyppisen valinnan analysoimiseksi valikointierot ja gradientit laskettiin palauttamalla kasvien kunto traits61: een. Tämä analyysi tehtiin erikseen käsittelyille, mutta kaikille toistoille ja sukupolville yhteensä. Kuntoarviona käytettiin ”käyntimäärää”, joka oli laskentamuuttuja ja seurasi Poisson-jakaumaa. Toisessa kelpoisuusmuuttujassa, ”suhteellisessa siemenkodassa”, oli hajonta monien nolla-arvojen vuoksi; lisäksi siemenkodista jäi pois ensimmäisen tarkastuskäynnin kohteena olleen kasvin ainoa miespuolinen kelpoisuuskomponentti, joka ei saanut siemeniä tältä tarkastuskäynniltä (koska pölyttäjillä ei alun perin ollut kaalin siitepölyä). Käyntien määrä korreloi kuitenkin vahvasti suhteellisen siemenjoukon kanssa (BB: r626=0, 694, p<0, 001; HF: r605=0, 597, p<0, 001). Yleistettyjä lineaarisia malleja (Poisson-jakaumalla) käytettiin laskemaan valintagradientit (monimuuttujat) ja differentiaalit (univariaatit) jokaiselle hoidolle, jossa käyntien määrä on riippuvainen muuttuja ja piirteet kovariaatteina. Lisäksi kvadraattiset valintagradientit laskettiin kaikilla piirteillä ja jokaisen piirteen neliötermi lisättiin malliin, ja myöhemmin gradientit kaksinkertaistuivat 62. Kimalaisten ja leijulintujen välisten valintaerojen tarkistamiseksi tehtiin yleistetty lineaarinen malli (Poisson-jakaumalla), jossa käyntien määrä oli riippuvainen muuttuja, hoito kiinteänä tekijänä, kasvien ominaisuudet kovariaatteina ja vuorovaikutushoito * kasvin ominaisuus. Ennen valinta-analyysia kaikki muuttujat standardoitiin niin, että ne tarkoittavat 0 ja S.d.=1 (Z-arvot) toistotasolla. Yleistettyä lineaarista mallia käytettiin myös kimalais – ja leijupölytteisten kasvien visitaationopeuksien vertailuun kaikissa sukupolvissa. Kukkien värispektrofotometriarvoja pienennettiin pääkomponenttianalyysillä (PC) varimax-rotaatiolla. Analyysissä käytettiin vain PC-tietokoneita, joiden eigenvalue oli suurempi kuin yksi.

Evoluutiomuutosta kasvien ominaisuuksissa arvioitiin 11.sukupolven kasveissa käyttäen monimuuttujaista lineaarista diskriminanttifunktioanalyysia ja univariaattisia yleisiä lineaarisia malleja (GLM). GLM: n osalta kutakin ominaisuutta käytettiin riippuvaisena muuttujana, toistettiin satunnaistekijänä ja hoitoa kiinteänä tekijänä LSD: n post-hoc-testillä. Erottaaksemme luonnonvalinnan vaikutuksen ajelehtimisesta arvioimme, olivatko ominaisuuserot yhdenmukaisia tietyn pölytyskäsittelyn toisintojen välillä. GLM-analyysissä merkittävä ”käsittelevä” vaikutus osoittaa eri pölyttäjäryhmien välisiä ominaisuuseroja kaikissa rinnakkaislajeissa ja erottaa siten pölyttäjäkohtaisen evoluution ajautumisesta. Kulkeutumisen osoittaisivat evolutiiviset muutokset vain joissakin (satunnaisissa) toisinnoissa, mikä olisi osoituksena ”toisinnuksen” tekijässä tai ”toisinnuksen” ja ”käsittelyn” välisessä vuorovaikutuksessa. Myös GLM arvioi itseyhteensopivuutta ja autonomista selfingiä, mutta ensimmäisen sukupolven voimaloiden arvot otettiin mukaan analyysiin. Haihtuvien aineiden ja meden tilavuuden analyysejä varten tiedot muunnettiin Ln (1 + x) normaalijakauman lähestymiseksi. VÄRIMUUTTUJIA sisältävälle GLM: lle tehtiin edellä kuvattu PC-analyysi, mutta muuttujia ei standardoitu etukäteen. PC-analyysi tehtiin kaikille hoidoille, rinnakkaisnäytteille ja kaikille sukupolville yhdessä, jolloin neljä PC: tä selitti 96,9% kokonaisvarianssista. Nektaruttomien kukkien esiintymistiheys analysoitiin erikseen kunkin sukupolven osalta käyttämällä yleistettyjä lineaarisia malleja, joissa on bimodaalijakauma ja joissa ’meden läsnäolo’ (kyllä/ei) on riippuvainen muuttuja ja käsittely ja monistuminen tekijöinä. Ominaisuudet nektariferous ja nektaruton kukkia verrattiin yhdeksännen ja yhdennentoista sukupolven yhdessä käyttämällä yleisiä lineaarisia malleja ominaisuus riippuva muuttuja, ja ’läsnäolo nektarin’ ja käsittely kiinteinä tekijöinä. Kimalaisten ja leijukärpästen ensivalintamieltymykset analysoitiin binomitestillä (test-prop=0,5; kaikki rinnakkaisnäytteet yhdistetty). Meden ja kasvien ominaisuuksien väliset korrelaatiot laskettiin kaikkien sukupolvien osalta käyttäen Pearsonin tuote-momenttikorrelaatioita ln-muuntuneiden arvojen kanssa. Tilastot tehtiin IMB SPSS Statistics-järjestelmällä (versio 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

tietojen saatavuus