INTRODUCTION

Halofiilit ovat mielenkiintoinen ryhmä korkealla suolapitoisuudella viihtyviä eliöitä. Nämä organismit voidaan luokitella suurin piirtein niiden optimaalisen suolapitoisuuden perusteella lieviin halofiileihin (1-6%, w/v NaCl), kohtalaisiin halofiileihin (7-15%) ja äärimmäisiin halofiileihin (15-30%) (Madigan and Martinko, 2006). Laaja tutkimus on osoittanut, että halofiilit eivät rajoitu mihinkään elämän verkkotunnuksia, ne voivat olla eukaryootit (Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar ym., 2005) eli bakteerien ja Arkeonien domeeneihin kuuluvia prokaryootteja. Levien suku Dunaliella ja suolakatkarapu Artemia (Boetius ja Joye, 2009) ovat esimerkkejä halofiilisistä eukaryooteista, kun taas Halobakteerit ja Salinibakteerit ovat esimerkkejä halofiilisistä prokaryooteista. Halofiilien menestyminen erittäin suolaisissa ympäristöissä johtuu ainutlaatuisista fysiologisista mukautumisista, kuten ionipumppausstrategiasta ja orgaanisten liuosten kertymisestä (Oren, 2006; Madigan and Martinko, 2006). Genomi-ja proteomitasoilla halofiileille on ominaista korkea GC-pitoisuus ja proteiinit, joille on ominaista alhainen hydrofobisuus, happamien jäämien yliedustus, helixin muodostumisen matalammat taipumukset ja Kelan rakenteen korkeammat ominaisuudet (Paul et al., 2008).

Halofiilit pääsevät nyt enemmän käsiksi teolliseen mikrobiologiaan ja bioteknologiaan, koska halofiilit kasvavat suuressa suolapitoisuudessa ja tämä minimoi kontaminaatioriskin viljelyn aikana (Oren, 2006). Harvoja esimerkkejä bioteknisistä sovelluksista on Micrococcus varianien käyttö nukleaasi H: n (Kamekura el al., 1982) ja halofiilisten Tetragenokokkikantojen käyttö soijakastikkeen tuotannossa ja eräiden entsyymien, kuten hydrolaasien (amylaasit, nukleaasit, fosfataasit ja proteaasit) tuotannossa (Oren, 2006). Halofiilit ovat tärkeitä myös biohajoamisessa ja bioremediassa, sillä monet halofiilit kykenevät hajottamaan hiilivetyjä ja muita myrkyllisiä yhdisteitä (Ventosa et al., 1998). Halofiilit voivat tuottaa myös öljyntorjunnan tehostajina käytettäviä polymeerejä pinta-aktiivisten aineiden ja bioemulsifiointiominaisuuksiensa vuoksi (Oren, 2006).

Halofiilit viihtyvät ympäristöissä, joissa suolapitoisuus on korkea, kuten valtamerissä, aurinkosuolissa ja luonnon suolajärvissä (Oren, 2007). Jordanian Kuollutmeri on yksi maailman suurimmista hypersaliinisista sisämaan suolajärvistä (Boetius ja Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan ja Martinko, 2006). Lisäksi korkea suolapitoisuus; suola, pitoisuus yli 340 g L-1 (Oren, 2007), Kuollutmeri on ainutlaatuinen sen korkea ilmanpaine (800 mmHg) johtuen hyvin alhainen korkeus merenpinnan alapuolella, osittainen happipaine (pio2) on 8% enemmän kuin merenpinnan tasolla, ainutlaatuinen UV-säteily, alhainen kosteus (alle 40%) ja Vähäinen sade (Avriel et al., 2011).

tässä tutkimuksessa luokiteltiin halofiilinen heterotrofinen bakteerilaji, joka viihtyy Jordanian Kuolleenmeren littoraalivyöhykkeellä. Mikrobiluokitus perustuu siirtomaa-ja solumorfologiaan sekä samankaltaisuuteen 16S rRNA-geenissä.

materiaalit ja menetelmät

näytteenotto: Kuolleenmeren vesinäytteet kerättiin neljältä littoraalivyöhykkeeltä (Kuva. 1) maalis -, kesä-ja lokakuussa 2011. Näytteenottopaikkojen Maantieteelliset koordinaatit ja korkeus on esitetty taulukossa 1. Maantieteelliset koordinaatit ja korkeus määritettiin kullekin paikkakunnalle (eTrex Legend C, Taiwan). Kuolleenmeren vesinäytteet kerättiin 1 litran puhtaaseen steriiliin lasipulloon, joka jätti pulloon riittävästi päätilaa ja kuljetettiin välittömästi laboratorioon.

näytteiden fysikaalis-kemiallinen analyysi: Vesinäytteiden lämpötila, pH, liuenneiden kiintoaineiden kokonaismäärä (TDS) ja Biologinen hapenkulutus (BOD) määritettiin. Veden lämpötila, pH ja suolaisuus mitattiin paikan päällä. Veden lämpötila ja pH mitattiin kannettavalla pH-mittarilla (mikrotietokoneen pH-mittari T19000, Trans-instrumentit). Suolapitoisuus mitattiin kädessä pidettävällä suolapitoisuusrefraktometrillä. BOD mitattiin (Water, Environment and Arid Regions research Center, Al al-Bayt University, Jordan). Vesinäytteet siirrettiin uuteen lasipulloon, jonka jälkeen litraan lisättiin 1 mL fosfaattipuskuria, magnesiumsulfaattia, kalsiumkloridia, rautakloridiliuosta. Tämän jälkeen näyte nostettiin lämpötilaan 20±3°C ja kyllästettiin orgaanisella suodatetulla ilmalla. Näytteen pH tarkastettiin. Jos näyte ei ollut välillä 6,5-7,5, lisättiin rikkihappoa tai natriumhydroksidia, jotta näyte saatiin vaaditulle pH-alueelle (6,5-7,5), eikä lisätty pitoisuus laimentanut näytettä yli 0,5%. Näyte nostettiin 20°C: n lämpötilaan ennen laimentamista. Sopiva määrä näytettä siirrettiin sitten BOD-pulloihin. Pullo täytettiin sen verran laimennusvedellä, että se syrjäytti kaiken ilman, joka ei jättänyt kuplia. Liuennut happi (DO) määritettiin DO-analysaattorilla, ja Syrjäytynyt sisältö korvattiin laimennusvedellä ja suljettiin tiukasti. Pulloa inkuboitiin 5 päivää 20°C: ssa.tämän jälkeen määritettiin DO ja BOD laskettiin alkuperäisen ja lopullisen DO: n tilavuuden eron mukaan.

rikastuminen, eristäminen ja gramvärjäys: Vesinäytteiden rikastamiseksi Kuolleenmeren vesi (10 mL) siirrettiin 90 mL: aan nestettä, jonka suolapitoisuus on suuri, ja inkuboitiin pimeässä 30°C: ssa ravistamalla (100 rpm). Noin 12 tunnin kuluttua rikastusviljelmää juostiin muunnetulla kiinteällä mineraalisuola-aineella ja erotetut pesäkkeet viljeltiin alakulttuureina. Myös isolaattien glyserolivarastot valmistettiin ja varastoitiin -20°C: n lämpötilaan lisätutkimuksia varten. Solut värjättiin grammoina ja tutkittiin mikroskoopilla.

16s rRNA-geenien sekvensointi ja analysointi: 16s rRNA-geenisekvenssin monistamisen ja sekvensoinnin suoritti Macrogen Inc. Soul, Korea, seuraavan menetelmän mukaisesti: bakteerikantojen nuoret pesäkkeet suspendoitiin 1,5 mL: n sentrifugiputkeen, joka sisälsi 0,5 mL steriiliä suolaliuosta, ja sentrifugoitiin sitten 10 000 rpm: ssä 10 minuutin ajan supernatantti poistettiin ja pelletti suspendoitiin 0,5 mL: aan InstaGene-matriisia (Bio-Rad, USA), inkuboitiin 56°C: ssa 30 minuutin ajan ja sen jälkeen kuumennettiin 100°C: seen 10 minuutin ajan. Kuumennuksen jälkeen PCR: ään käytettiin supernatanttia. PCR suoritettiin sekoittamalla 1 µL templaatti-DNA: ta 20 µL: aan PCR-reaktioliuosta. 27F / 1492R alukkeet (27F: 5 ’ – AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: 5’-tac GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) käytettiin vahvistamiseen, minkä jälkeen suoritettiin 35 vahvistussykliä 94°C: ssa 45 sekunnin ajan, 55°C: ssa 60 sekunnin ajan ja 72°C: ssa 60 sekunnin ajan. Noin 1 400 bp: n puhdistetut PCR-tuotteet sekvensoitiin 518f/800R-alukkeilla (518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’ – TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Sekvensointi suoritettiin käyttämällä Big Dye terminator cycle sequencing kit v. 3.1 (Applied BioSystems, USA). Sekvensointituotteet ratkaistiin Macrogen, Inc: ssä sovelletulla Biosystems model 3730xl automated DNA sequencing Systemillä (Applied BioSystems, USA). Soul, Korea.

sekvenssit analysoitiin ja verrattiin julkiseen nukleotiditietokantaan käyttäen NCBI: n BLAST-verkkosivustoa (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Lähimpien sukulaisten sekvenssit haettiin sitten tietokannasta ja käytettiin fylogeneettisen puun rakentamiseen MEGA5: n avulla (Tamura et al., 2011). GC-pitoisuus sekvenssit laskettiin Oligolaskimella (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

tulokset

näytteiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet: Kuolleenmeren vesinäytteet olivat hyvin suolaisia (36-38%). Näytteiden pH-arvot olivat alhaiset ja vaihtelivat välillä 5,6-6,3. Tämä viittaa meriveden lievästi happamaan ominaisuuteen. BOD-arvo oli hyvin alhainen (1-2 mg O2 L-1), mikä viittaa hyvin alhaiseen orgaanisen aineen pitoisuuteen näytteessä. Fysikaalis-kemialliset ominaisuudet on esitetty taulukossa 2.

heterotrofinen elinkykyinen bakteerimäärä: elinkelpoisten kantojen lukumäärän tulokset osoittivat, että kussakin näytteessä on hyvin vähän pesäkkeitä muodostavia yksiköitä (200-6000 pmy mL-1). PMY: n määrä esitetään yksityiskohtaisemmin taulukossa 3.

Halofiilisten heterotrofisten bakteerien eristäminen ja luokittelu: tässä tutkimuksessa on eristetty 44 halofiilista heterotrofista bakteerikantaa. Yksitoista bakteerikantaa 44: stä pidettiin erilaisina kolonialistisen morfologian, Gramvärjäyksen ja solumorfologian perusteella. Seitsemän yhdestätoista eri kannasta oli grampositiivisia ja neljä seitsemästä gramnegatiivisia. Bakteerikannat tunnistettiin 16S rRNA-geenianalyysin perusteella ja niiden todettiin kuuluvan bakteerien alaan. Kunkin eristetyn bakteerikannan lähin sukulainen on esitetty taulukossa 4 ja Kuvassa. 2. Kaikissa sekvensseissä oli suhteellisen korkea GC-pitoisuus (jopa 58%).

keskustelu

Kuolleenmeren näytteiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet määritettiin ja analysoitiin. Suolapitoisuusprosentin todettiin olevan erittäin korkea (jopa 38%). Tämä on tyypillinen ominaisuus Kuolleenmeren vesi tekee siitä yhden kuuluisan ”athalassohaline” brines (Oren, 2007). Kuolleenmeren veden pH todettiin lievästi happamaksi (5,6-6,3) verrattuna talassohaliinibriinien pH-arvoon (7,5-8) (Oren, 2007). Näytteiden BOD oli hyvin alhainen (1-2 mg O2 L-1), mikä heijastaa alhaista orgaanista ainesta vedessä, jota heterotrofiset bakteerit voisivat hyödyntää. Nämä fysikaalis-kemialliset olosuhteet vaikuttavat epäilemättä negatiivisesti mikrobien monimuotoisuuteen. Sen vuoksi elinkelpoisten solujen määrä testatuissa näytteissä oli hyvin pieni (enintään 6×102 PMY mL-1) verrattuna avomeriveteen. Heterotrofisten bakteerien määrä merivesissä on yleensä luokkaa 105-106 bakteeria mL-1 (Zweifel and Hagstrom, 1995; Madigan and Martinko, 2006). Nämä luvut ovat peräisin epäspesifisistä fluoresoivista värjäystekniikoista (Zweifel ja Hagstrom, 1995), joilla saadaan yleensä suuremmat luvut kuin elinkelpoisella laatulukumenetelmällä. Ensimmäiset julkaisut Kuolleenmeren bakteerimääristä tehtiin mikroskopian avulla. Solun numero oli noin 1.9×106 soluja mL1 ja aikana kukinta punainen halobakteerien populaatiotiheys saavutti 1. 9×107 mutta laski jälkeen Koit 5×106 (Oren, 1983).

Kuolleenmeren halofiilisten eliöiden tutkimus alkoi hyvin varhain vuonna 1892, kun Clostridium-suvun bakteereita eristettiin mudasta (Oren, 2002). Myöhemmin vuonna 1936 julkaistussa lyhyessä artikkelissa esitettiin ensimmäinen kuvaus Kuolleenmeren äärimmäisen ankariin oloihin sopeutuneesta kotoperäisestä mikrobiyhteisöstä (Oren and Ventosa, 1999). Siitä lähtien tietämyksemme Kuolleenmeren biologisista näkökohdista on laajentunut ja karttunut. Teimme tämän tutkimuksen laajentaaksemme tietämystämme halofiilisesta heterotrofisesta bakteerista, joka kukoistaa Jordanian Kuolleenmeren littoraalialueella. Olemme eristäneet eri bakteerilajeja. Sen jälkeen eristimme ja tunnistimme 11 erilaista halofiilistä bakteerilajia. Useimmat isolaatit olivat grampositiivisia (7/11). Vaikka Gram-positiivisilla bakteereilla on tärkeitä mukautuksia, joiden avulla ne voivat sopeutua ympäristökuormitukseen, kuten suureen suolapitoisuuteen (Battistuzzi and Hedges, 2009). Kirjallisuudessa ei ole selvää, ovatko grampositiiviset vai Gramnegatiiviset bakteerit hallitsevia hypersaliinisissa ympäristöissä. Yhdessä tutkimuksessa prokaryoottisia halofiileja talteen sedimenteistä matala El-Djerid suolajärvi Tunisiassa, Hedi et al. (2009) havaitsi, että hallitseva bakteerikanta kuuluu grampositiivisiin itiöitä muodostaviin bakteereihin.

Kaikki tämän tutkimuksen eristetyt kannat kuuluvat bakteerien alaan. Ne kuuluvat 7 eri sukuun alaheimossa. Viisi seitsemästä Grampositiivisesta bakteerisolaatista kuuluu Bacillus-sukuun. Suku perustettiin vuonna 1872 käsittämään kolme lajia, mutta nyt Bergeyn ”Manual of Systematic Bakteriology” – käsikirjaan on listattu 142 nimettyä Bacillus-lajia (Logan and de Vos, 2009). Bacillus-kannat ovat tyypillisesti maaperäkantoja. Tässä tutkimuksessa eristetyt Bacillus-kannat kuuluvat seuraaviin lajeihin B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis ja B. cereus. Näitä kantoja tavattiin erilaisissa suolaisissa ympäristöissä (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Yoon et al., 2004; Al-ZaZaee et al., 2011). Esimerkiksi B. licheniformis on aiemmin talteen meren sedimenteistä Miranda et al. (2008), kun taas B. pumilus eristettiin meren eliöistä kuten ostereista, ravuista ja kaloista sedimenttien lisäksi Parvathi et al. (2009). B. hwajinpoensis otettiin talteen itäisen meren ja Keltaisenmeren merivedestä Koreassa (Yoon et al., 2004). Ja lopuksi jätevedessä tavattiin B. cereus, yleinen maabakteeri, jolla oli halofiilisia ominaisuuksia (Al-ZaZaee et al., 2011). Paksu soluseinä, korkea peptidoglykaanipitoisuus (yli 90% soluseinästä) (Madigan ja Martinko, 2006), korkea GC-pitoisuus ja resistenttien itiöiden muodostuminen ovat tärkeimmät syyt bacilluksen selviytymiseen ankarissa olosuhteissa, kuten suuressa suolapitoisuudessa. On huomattava, että kanta DSD32 (tunnistettu B. cereus) on hyvin alhainen samankaltaisuus sen lähimmän sukulaisen B. cereus. Tämä kanta saattaa edustaa uutta lajia Bacillus-suvussa perustuen 16s rRNA-geeniin.

kaksi muuta Grampositiivista bakteeria ovat Artrobacter sp-kantoja. ja Kocuria rosea. Arthrobacter lajit ovat laajalti levinneet luonnossa erityisesti maaperässä (Funke et al., 1996), mutta se ei ole kovin yleinen hypersaliinisissa ympäristöissä. Kocuria rosea pidetään kohtalaisen halofiilinen laji ja se otettiin talteen eri suolaliuoksessa ympäristöissä, kuten saline open matala vesi ja jotkut kannat Kocuria rosea kasvaa optimaalisesti NaCl pitoisuus 30% (Wright and Tanaka, 2002).

gramnegatiivisia bakteereja esiintyi vähemmän näytteissämme (4/11). Kuitenkin julkaistu kirjallisuus osoittaa, että nämä isolaatit eivät ole harvinaisia suolaisessa ympäristössä. Yksi eristetyistä kannoista tunnistettiin Vibrio alginolyticus-lajiksi. Jälkimmäinen laji on itse asiassa yleinen merinäytteissä (Molitoris et al., 1985) ja tavattiin merivedessä. Kannalla on lääketieteellistä merkitystä, koska se voi aiheuttaa monimutkaista iho-ja pehmytkudosinfektiota (Sganga et al., 2009). Vielä tärkeämpää on, että joidenkin Vibrio alginolyticus-kantojen havaittiin tuottavan tetrodotoksiinia, voimakasta hermotoksiinia (Noguchi et al., 1987). Toinen tutkimuksessa tunnistettu gramnegatiivinen bakteeri on Chromohalobacter salexigens. Laji eristettiin ensin ja kuvattiin kohtalaisen halofiiliseksi lajiksi Halomonas elongata, minkä jälkeen sitä ehdotettiin uudeksi Chromohalobacter-lajiksi (Arahal et al., 2001). Erytrobacter gaetbuli on toinen tässä tutkimuksessa tunnistettu laji. Tämä kanta ei myöskään ole harvinainen suolaisissa elinympäristöissä. Se eristettiin hiljattain Keltaisenmeren vuorovesitasangolta Koreassa ja Yoon et al kuvaili sitä halofiiliseksi lajiksi. (2005). Viimeinen kanta kuuluu Salinivibrio costicolaan. Laji kuvattiin aluksi nimellä Vibrio costicola, mutta sen fenotyyppiset ja genotyyppiset ominaisuudet erottivat sen Vibrio-suvun lajeista. Siksi kanta sijoitettiin uuteen erilliseen sukuun nimeltä Salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola on kohtalaisen halofiilinen ja eristettiin alun perin suolatusta ruoasta ja kasvaa optimaalisesti 10% suoloja sisältävissä väliaineissa (Mellado et al., 1996). Salinibacter-suvun jäsen S. ruber on mielenkiintoinen malli mikro-organismien sopeutumista elämään suurilla suolapitoisuuksilla (Oren, 2007).

johtopäätös

littoraalivyöhykkeeltä peräisin olevalle kuolleelle merivedelle on ominaista korkea suolapitoisuus, alhainen pH, Alhainen orgaanisen aineksen pitoisuus (Alhainen BOD), ja se hillitsee sekä grampositiivisiin että gramnegatiivisiin sukuihin kuuluvia heterotrofisia bakteerilajeja, mukaan lukien Arthrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus ja Erytrobacter.

tunnustus

tätä tutkimusta tuki al al-Bayt Universityn akateemisen tutkimuksen deanship, Jordania, päätös tieteellisen tutkimuksen neuvoston kokouksessa nro 2/2010/2011. Kirjoittaja haluaakin arvostaa yliopiston antamaa taloudellista apua.