Bone mineral: new insights into its chemical composition
hpo4 2− ionien tunnistaminen luunmineraalissa
luunmineraalissa olevien protonien suora solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) – havaitseminen ehjästä luukudosnäytteestä ei ole mahdollista. Tämä johtuu solunulkoisen orgaanisen matriisin läsnäolosta, jonka erilaiset signaalit hallitsevat luukudosnäytteen 1H: n yksittäistä pulssia (sp) ssNMR-spektriä 54. Kaksiulotteisessa (2D) {1h}31P Heteronuclear Correlation (HetCor) ssNMR-kokeessa on kuitenkin mahdollista paljastaa atomiasteikon spatiaalisia proksimiteetteja vedyn ja fosforin ytimistä, mikä mahdollistaa luun mineraalivetyympäristöjen tutkimisen F1-ulottuvuuden analyysin avulla (kuva. 1 A). Valitettavasti tämä kokeilu on aikaa vievä ja aiheuttaa 1h projektio pystysuora (F1) ulottuvuus suhteellisen huono signaali-kohina-suhde (S/N) ja alhainen digitaalinen resoluutio (Fig. 1b). Näiden rajoitusten poistamiseksi käytimme yksiulotteista (1D) {1h-31P}1h double cross polarisation (CP) ssNMR-koetta. Se koostuu kahden CP-siirron suorittamisesta ”sinne ja takaisin” – tavalla (1H→31P→1h) (Kuva. S1). Ensinnäkin tämä koe antoi meille mahdollisuuden saada 31P-suodatettua 1h ssNMR-spektriä luun mineraalista ehjästä, kortikaalisesta 2-vuotiaasta lampaan luukudosnäytteestä erinomaisella S/N: llä suhteellisen lyhyestä hankinta-ajasta (eli 9 tuntia) huolimatta (kuva. 1C, D). Luunmineraalin erilaiset 1h-kemialliset ympäristöt ovat nyt helposti havaittavissa ja niitä voidaan turvallisesti analysoida tarkasti. Luun mineraalihiukkasten sisäisessä kiteisessä ytimessä havaitaan hydroksiapatiitin kidehilassa olevat hydroksyyli-ionit kompleksiresonanssina, jonka keskipiste on δ (1h) = 0,0 ppm. Amorfisen pintakerroksensa osalta rakenteelliset vesimolekyylit ja happamat fosfaattilajit, joita esiintyy ei-apatiittisissa ympäristöissä, ovat havaittavissa yhden resonanssin muodossa, jonka keskipiste on δ(1h) = 5.2 ppm ja laaja resonanssi, joka vaihtelee välillä δ(1h) = 7-17 ppm32.
toiseksi tämän kokeen avulla 1H-havaitun CP-dynamiikan tutkimus paljastaa valikoivasti 31P-ytimien läheisyydessä olevien 1h-tumien luonteen. Tätä varten kosketusaika 1 (tCP1) pidettiin kiinteänä 1000 µs: ssa, kun taas kosketusaika 2 (tCP2) vaihteli 75 µs: sta 1000 µs: iin (Kuva. 2). Magnetoinnin tasaista kasvua havaitaan sekä δ(1h) = 0,0− että δ(1h) = 5,2 ppm-resonansseille (KS.Mustat dashed-viivat), jotka on aiemmin liitetty OH-ioneihin ja rakenteellisiin H2O-molekyyleihin niiden 1h NMR-kemiallisen muutoksen mukaisesti. Sen sijaan laajan signaalin kehitys alueella δ(1h) = 7-17 ppm osoittaa aluksi sen magnetoitumisen nopean kasvun (jopa tCP2 = 300 µs) ja sitä seuraa oskilloiva käyttäytyminen (jopa tCP2 = 1250 µs – katso musta hajaraja). Tämä oskillatorinen käyttäytyminen on ominaista 1H-31P dipolaariselle (DP-H) oscillations55,56. Vastaavien {1h-31P}1h ssNMR-spektrien sovittaminen eri tcp2: een ei ole suoraviivaista johtuen eri resonanssien päällekkäisyydestä. Kun taas synteettiset HA näytteet yleensä näytteille symmetrinen OH-resonanssi32; osoitamme tässä, että luun mineraalin Oh-resonanssi on erityisen monimutkainen ja se voidaan sovittaa seuraavasti: pääpiikki δ(1h) = 0,0 ppm, jota ympäröi kaksi hartiahuippua δ(1h) = -0,7 ja 0,9 ppm (Kuva. S3). Jäännösrakenteisen veden resonanssi voidaan oikein asentaa yhden piikin keskiössä δ(1h) = 5,2 ppm (Kuva. S4). Sitä vastoin happamien fosfaattilajien laajaa signaalia, joka on havaittavissa alueella δ(1h) = 7-17 ppm, ei voida tyydyttävästi sovittaa yhteen yksittäiseen piikkiin, jossa on kiinteä sijainti ja viivan leveys, varsinkaan lyhyillä kosketusajoilla (KS.parhaiten sopivat tulokset eri Tcp2-arvoista Kuvassa. S4-vasen sarake). Asennustulokset ovat kuitenkin tarkkoja, kun käytetään kahta eri piikkiä, joissa on kiinteät asennot ja kiinteän linjan leveydet (6,2 ± 0,1 ja 5,0 ± 0,1 ppm) (Kuva. S4-oikea sarake). Emme voi väittää, että tämä laaja signaali koostuu vain kahdesta piikistä, jotka vastaavat kahta erillistä protoniympäristöä, mutta se koostuu todennäköisesti laajasta kemiallisten ympäristöjen jakaumasta, joka johtaa NMR: n kemiallisten siirtymien jakautumiseen. Niinpä, Fig. 3A esittää neljä piikkiä, joita käytettiin luun mineraalin 31P-suodatetun 1h ssNMR-spektrin analysointiin kullekin tCP2-arvolle: i) komposiittihuippu, jonka keskipiste on δ (1h) = 0, 0 (violetti) , ja yksi piikki, jonka keskipiste on δ(1h) = 5, 2 (harmaa) ppm, joille on molemmille ominaista niiden magnetizaatioiden suhteellisen hidas ja tasainen kasvu; ja ii) kaksi piikkiä δ(1h) = 9.8 (sininen) ja 14.0 (vihreä) ppm, jotka molemmat osoittavat dipolaarista heilahtelua (Kuva. 3b). Näiden kahden jälkimmäisen huipun osalta Hartmann-Hahn (H-H) – Profiilin Tarkka vastaavuus (Kuva. S2) mahdollistaa CP-kertymäkäyrien numeerisen mallintamisen yhden spin-parin mallin mukaisesti, joka vastaa koherentista polarisaatiosiirrosta johtuvia dipolaarisia värähtelyjä ja 1h spin-diffusionin vaikutusta 57:
luun mineraalissa olevien hpo42− ionien kvantifiointi suoritettiin. Tätä varten lineshape ja linewidth yksittäisten 31P NMR signaaleja OH− ja PO43-sisältävät sisäistä kiteistä ydintä ja H2O ja HPO42-sisältävät ei-apatiittisia ympäristöjä (amorfinen pintakerros), jotka paljastettiin Fig. 4B, käytettiin tuoreen 2-vuotiaan lampaan luukudosnäytteen kvantitatiivisen 31P: n yksittäisen pulssin (sp) mas ssNMR-spektrin sovittamiseen (Kuva. 5 A). Luun mineraalissa olevien hpo42− ja PO43− ionien mooliprosenttiosuuden todettiin olevan noin 50/50 ± 5%. Kuten havainnoistamme Figs S9 ja S10 viittaavat, tämä laskelma tehtiin olettaen, että hpo42− ionien mooliosuus hiukkasten sisäisessä kiteisessä ytimessä oli lähellä 0%. Amorfisessa pintakerroksessa olevien hpo42-ionien suuri mooliosuus heijastaa luun mineraalihiukkasten pientä kokoa: ∼1-5 nm paksuudeltaan, ∼10-40 nm leveydeltään ja ∼20-100 nm pituudelta1, 61,62, 63. Koska osoitimme, että hpo42-ionit ovat keskittyneet amorfiseen pintakerrokseen, voimme nyt arvioida tämän kerroksen keskimääräisen paksuuden 2-vuotiaalle lampaan luukudosnäytteelle. Tässä tarkastellaan nanosidottua verihiutaletta, jonka paksuus on 4,0 nm, ja oletamme, että hydroksiapatiitin kidehilassa ja amorfisessa pintakerroksessa olevien fosfaattiatomien tiheydet ovat ekvivalentit. Tällaisessa skenaariossa sisäisen kiteisen ytimen paksuus on noin 2,4 nm (so., joka on noin kaksi kertaa hydroxyapatite64: n heksagonaalisen yksikkösolun kokoinen kristallografisia akseleita A ja b pitkin; a = b = 0,94 nm); kun taas ulomman amorfisen pintakerroksen paksuuden voidaan arvioida olevan noin 0,8 nm (eli se vastaa hydroksiapatiitin heksagonaalisen yksikkösolun kokoa A: ta ja b: tä pitkin ja siten vastaa vain kahden fosfaatti-ionin pinoamista). On syytä olla tietoinen siitä, että nämä ovat keskiarvoja, jotka vastaavat kaikkien epäorgaanisten fosfaatti-ionien osuutta 2-vuotiaan lampaan luukudosnäytteessämme. Nämä tulokset voivat olla erilaisia vanhemmalla yksilöllä, jossa ei-apatiittisten ympäristöjen osuus saattaa olla pienempi 65 luun mineraalin kypsymisen vuoksi: amorfisen pintakerroksen asteittainen muuttuminen apatiittisiksi ympäristöiksi15. Kuitenkin tässä määritetty pintakerroksen paksuus (0,8 nm) on hyvässä yhteisymmärryksessä joidenkin aiempien tutkimusten arvioitujen kokojen kanssa: noin yhden fosfaattiyksikön koko fluoriapatiitissa-gelatiinissa mesocrystals66; ja noin 1-2 nm synteettisissä hydroksiapatiiteissa32,67,68.
Update on bone mineral chemical composition
tässä ja muussa45 esitetyt tulokset viittaavat siihen, että Legros et al: n ehdottama kypsän kortikaalisen luun mineraalin keskimääräinen kemiallinen koostumus.27, Ca8. 3□1,7(PO4)4,3(HPO4 tai CO3)1,7 (oh tai ½ CO3)0,3□1,7, on harkittava uudelleen. Tässä kaavassa ei nimittäin oteta huomioon ainoastaan sitä amorfista pintakerrosta, jonka kemiallinen koostumus vaihtelee suuresti hiukkasten sisäisessä kiteisessä ytimessä oleviin apatiittisiin ympäristöihin nähden, vaan aliarvioidaan myös HPO42− ionien mooliosuus. Jotta voisimme ehdottaa ajantasaista kaavaa 2-vuotiaasta lampaan luukudosnäytteestämme, meidän oli ensin määritettävä CO32-ionien paino-osuus. Arvo 4,8%, jolla on merkittävä osuus B-tyypin karbonaateissa, havaittiin ft-IR-analyyseissä49 (Kuva. 5B), joka vastaa muiden luun mineraalinäytteiden arvoja 3. Lisäksi tarkasteltiin seuraavia parametreja: I) hiukkasten on pysyttävä sähköisesti neutraaleina (sekä sisäinen kiteinen ydin että amorfinen pintakerros); ii) hpo42− ionien mooliosuus epäorgaanisten fosfaatti-ionien kokonaismäärään nähden on rajoitettu lähelle 50: tä prosenttia tämän tutkimuksen mukaan; iii) karbonaatioasteen on oltava lähellä kokeellista arvoa (4,8% w/w); iv) Ca/(P + C) – moolisuhteen on pysyttävä hyväksyttävänä luukudosnäytteelle, I.e. välillä 1,2-1,53 ja viimeisenä v A-tyypin, B-tyypin ja muiden kuin apatiittikarbonaatti-ionien osuuden amorfisessa pintakerroksessa olisi pysyttävä FT-IR-tietojen mukaisena. Kun kaikki nämä rajoitteet on amalgamoitu, kypsän kortikaalisen luun mineraalin keskimääräinen kemiallinen koostumus 2-vuotiaasta lampaan luukudosnäytteestämme voidaan approksimoida seuraavasti: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. On huomattava, että tämä keskimääräinen kemiallinen koostumus vastaa yksinomaan meidän erityistä luukudosnäytettä omien kokeellisten tulosten mukaan. Näin ollen tämä kaava ei ole yleinen, koska luuyksilöiden välillä esiintyy vaihtelua riippuen erityisesti lajista, iästä, ravinnonsaannista ja niiden kypsymisasteesta.