Diseño experimental y sistema de estudio

En 2012, se obtuvieron 300 semillas de plantas de ciclo rápido Brassica rapa (semilla estándar de Wisconsin Fast Plants, con alta variación genética) de Suministros biológicos de Carolina, y se cultivaron en un fitotrón bajo condiciones estandarizadas de suelo, luz y riego. Estas plantas están completamente entrecruzadas (auto incompatibles) y albergan suficiente variación genética para responder fácilmente a la selección58,59. De estas 300 plantas, se generaron 108 familias de semillas de sib completas mediante cruces artificiales (solo se utilizaron familias de semillas de cruces donde ambos padres produjeron frutos). Estas 108 familias de semillas de sib completas se utilizaron como población inicial para el experimento.

Para la primera generación del experimento, se establecieron tres grupos de tratamiento utilizando las 108 familias para que cada familia estuviera representada en cada tratamiento para controlar el genotipo entre los tratamientos (Suplemento Fig. 1). Por lo tanto, cada tratamiento consistió en 108 plantas (que representaban 108 familias de semillas), que subdividimos en tres réplicas (A,B, C) que contenían 36 plantas cada una. Las réplicas dentro de los tratamientos se mantuvieron como líneas aisladas durante 9 generaciones (no se realizaron cruces entre réplicas) para poder evaluar cambios evolutivos independientes y repetibles. Las plantas de todas las réplicas en todos los tratamientos se cultivaron en el fitotrón bajo suelo estandarizado (Einheitserde classic), luz (luz de 24 h) y condiciones de riego. Todas las plantas fueron fenotipadas cada segunda generación a partir de la generación 1. Los datos de aroma floral de las generaciones 1 y 3 se perdieron debido a problemas técnicos; en su lugar, el aroma se recopiló de la generación 4. Los datos de aroma floral de la generación 1 se obtuvieron después del final del experimento mediante el re-cultivo de plantas de la generación inicial y la recolección de aroma de una planta de cada una de las 108 familias de semillas. Por lo tanto, de la primera generación, se muestrearon un total de 108 plantas (36 de cada réplica) en busca de aroma floral al mismo tiempo que las plantas de la generación 9.

Evolución experimental y tratamientos de polinización

En nuestro estudio utilizamos tres tratamientos polinizadores: abejorros (‘BB’, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Suiza), moscas volantes (‘HF’, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Alemania) y polinización manual. Ambos insectos visitan fácilmente las flores de muchas especies de Brassicaceae en la naturaleza, pero representan diferentes categorías de polinizadores funcionales, y se ha demostrado que varían en abundancia en los hábitats naturales46. El uso de especies polinizadoras individuales imita ambientes polinizadores en los que los polinizadores más abundantes son funcionalmente diferentes. En el tratamiento de control («CO»), las plantas elegidas al azar se polinizaron de forma cruzada a mano.

La polinización se realizó 23 días después de la siembra en una jaula de vuelo (2.5 m × 1.8 m × 1.2 m) en el invernadero bajo condiciones de luz estandarizadas con abejorros y moscas volantes. Los experimentos se realizaron entre las 09.00 y las 1.500 horas. Los abejorros fueron mantenidos en una jaula de vuelo separada en el invernadero. Las moscas volantes se compraban como pupas y se criaban hasta la eclosión, después de lo cual se separaban las moscas macho y hembra. A los polinizadores se les permitió forrajear en plantas de ciclo rápido de B. rapa (plantas del grupo de control de la generación respectiva) y se les alimentó con polen adicional hasta 3 días antes del tratamiento de polinización; después, solo se les proporcionó polen y solución de azúcar; 16 h. antes de la polinización, los polinizadores murieron de hambre.

Para la polinización, todas las plantas de una réplica se colocaron aleatoriamente en un cuadrado de 6 × 6 plantas a una distancia de 20 cm entre sí en la jaula de vuelo. Se agregaron cinco polinizadores de forma individual y secuencial y se permitió que cada insecto visitara un máximo de tres plantas diferentes y luego se retirara de la jaula; cada insecto se usó solo una vez. En total, entre 12 y 15 plantas por réplica recibieron una o más visitas de polinizadores. El promedio general (±d.c.) de visitas (en plantas visitadas) fue de 1,35±0,63 para plantas polinizadas por abejorros y de 1,28±0,53 para plantas polinizadas por moscas volantes. Para las plantas visitadas, se registró el número de visitas y el número de flores visitadas. En el grupo de control, se eligieron 12 plantas al azar por réplica y 5 flores de cada planta fueron polinizadas a mano por una planta padre elegida al azar; los padres fueron elegidos de entre las mismas 12 plantas. Cada planta podía ser donante de polen a más de una planta, pero solo recibía polen de una planta. Después de la polinización, se marcaron las flores visitadas y las plantas se mantuvieron en una jaula durante 30 días adicionales hasta que se recolectaron los frutos. Se contaron las semillas y se calculó el conjunto relativo de semillas para cada planta dividiendo el conjunto individual de semillas por el conjunto medio de semillas en la réplica. Además, se calculó el número de semillas por fruto para cada planta visitada. Para cada planta se estimó la aptitud masculina como paternidad predicha (número de eventos de exportación de polen).

De todas las semillas producidas por las flores polinizadas, se utilizó un subconjunto de semillas representativas de la producción de semillas de cada individuo para cultivar la próxima generación. Cuantas más semillas produjera una planta, más semillas aportaría a la siguiente generación, que de nuevo constaba de 36 plantas por cada réplica. La contribución de semillas de cada planta visitada a la siguiente generación se calculó para cada réplica como: 36 / (suma replicada de semillas / conjunto individual de semillas). Los valores inferiores a 0,5 se redondearon a 1.

Depresión endogámica

La depresión endogámica a lo largo del experimento se cuantificó midiendo el peso de las semillas y la tasa de germinación, esta última como porcentaje de semillas germinadas por réplica. Para el control de rasgo-cambios debido a la depresión endogámica, semillas producidas por las plantas de la 9ª generación han crecido (en representación de la 10ª generación) y manualmente cruzado entre repeticiones dentro de los tratamientos, de manera que las plantas de cada replicar fueron donante de polen y el polen de destinatarios para las plantas de dos diferentes repeticiones (♀Un-♂C, ♀B-♂Una, ♀C-♂B). Los cruces dentro de estas combinaciones de réplicas fueron aleatorios. De las semillas resultantes (la undécima generación), se cultivó un individuo por familia de semillas (36 plantas por réplica) en las mismas condiciones que durante el experimento. De estos cruces entre réplicas, los rasgos se midieron de nuevo y se utilizaron para la comparación final de los rasgos entre los grupos de tratamiento.

Rasgos de la planta

La mayoría de los rasgos, incluido el aroma floral, se midieron antes de la polinización, 19-21 días después de la siembra. El ancho, la longitud, la longitud del pistilo y el diámetro de la flor de tres flores elegidas al azar por planta se midieron con una pinza electrónica (Pinza digital 0-150 mm,TOOLCRAFT). El néctar de tres flores se recolectó con tubos micro capilares de 1 µl (Blaubrand, Wertheim, Alemania) y el volumen se determinó midiendo la longitud de la columna de néctar en la micropipeta con una pinza. Para la cuantificación se utilizó la media de tres flores. Para 157 plantas divididas uniformemente en los tratamientos, el contenido de azúcar del néctar se determinó mediante derivatización y análisis cromatográfico de gases. Para ello, el néctar se transmitía al papel de filtro almacenado en gel de sílice. El sector del papel de filtro que contenía el néctar se cortó del resto del papel de filtro y el néctar se eluyó en 1 ml de agua Mili-Q de alta pureza agitando la dilución durante 90 minutos con 400 rpm a 60 °C en un agitador de laboratorio. Posteriormente, se secaron 50 µl de la solución a 60 °C y se derivaron con 100 µl de una mezcla de piridina anhidra (Fisher Scientific, Geel, Bélgica), hexametilsilazano (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) y trimetilclorosilano (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) (10:5:3). Posteriormente, las muestras fueron procesadas por GC-MS como se describe en ref. 32. Calculamos las cantidades totales de azúcar por flor e inflorescencia como la suma de todos los azúcares diferentes (fructosa, glucosa, sacarosa y sorbitol). La correlación entre el contenido de azúcar de néctar y el volumen de néctar fue positiva y alta (r156 = 0.732, P< 0.001), por lo tanto, para las plantas restantes, solo se determinó el volumen de néctar. La colección de aromas florales se realizó antes de los bioensayos de manera no destructiva de todas las inflorescencias de plantas tan pronto como al menos cinco flores se abrieron. Usamos sorción en el espacio de la cabeza con un sistema push-pull59, 60. Las inflorescencias de las plantas se encerraron en cilindros de vidrio previamente recubiertos con sigmacote (Sigma-Aldrich) y cerrados con una placa de teflón. Se contó el número de flores abiertas para cada planta. El aire de los alrededores se introdujo con un caudal de 100 ml min−1 a través de filtros de carbón activado en el cilindro de vidrio. Simultáneamente, se extrajo aire del cilindro de vidrio con un caudal de 150 ml min−1 a través de un tubo de vidrio lleno de Ten 30 mg de Tenax TA (malla 60/80; Supleco, Bellefonte, PA, EE.UU.). El aire de los cilindros de vidrio vacíos se recogía como controles de aire. Los volátiles florales se recolectaron durante dos horas en un fitotrón bajo condiciones estandarizadas de luz y temperatura. La cuantificación de los volátiles se realizó mediante cromatografía de gases con detección selectiva de masa (GC-MSD). Las muestras se inyectaron en un GC (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE.UU.) mediante un muestreador multipropósito (MPS; Gerstel, Müllheim, Alemania) utilizando una unidad de desorción térmica de Gerstel (TDU; Gerstel) con un sistema de inyección en frío (CIS; Gerstel). Para la termodesorción, la TDU se calentó de 30 a 240 °C a una velocidad de 60 °C min-1 y se mantuvo a una temperatura final durante 1 min. El CIS se estableció a -150 °C durante la captura de compuestos liberadores de la TDU. Para la inyección, el CIS se calentó a 250 ° C a una velocidad de 12 °C s−1, y la temperatura final se mantuvo durante 3 min. El GC estaba equipado con una columna HP-5 (0,25 mm de diámetro, 0,25 µm de espesor de película, 15 m de longitud), y se utilizó helio como gas portador a un caudal de 2 ml min−1. La identificación y cuantificación de compuestos se realizaron a continuación 60 con el Programa Agilent MSD ChemStation. La cuantificación de los compuestos se obtuvo mediante la medición de las áreas de pico de iones objetivo seleccionados específicos de los compuestos aromáticos individuales. Los iones objetivo específicos se obtuvieron a partir de patrones sintéticos de todos los compuestos; las áreas de pico se convirtieron en cantidades absolutas utilizando curvas de calibración obtenidas previamente para cada compuesto utilizando compuestos sintéticos en tres concentraciones diferentes. En el análisis solo se incluyeron compuestos aromáticos que estaban presentes en cantidades significativamente mayores que en el control del aire (en total, 14 compuestos aromáticos). Todas las cantidades de volátiles se calcularon en pg por flor de aire muestreado l−1.

Veintitrés días después de la siembra, el mismo día de la polinización, se registró el número de flores abiertas y la altura de cada planta. Después de la polinización (pero el mismo día), los espectros de reflectancia de color de tres pétalos de diferentes flores no polinizadas (cuando sea posible) por planta se registraron utilizando un espectrofotómetro de fibra óptica (AvaSpec-2048; Avantes, Apeldoorn, Países Bajos) y una fuente de luz pulsada de xenón (AvaLight-XE; Avantes). Un pétalo a la vez se colocó debajo del espectrofotómetro (centrándose específicamente en la parte distal del pétalo) y el porcentaje de reflectancia (en relación con un estándar blanco) entre 200 y 900 nm cada 0,6 nm se registró en modo de transmisión. Del espectro medido, solo se utilizó en el análisis la media de los valores de reflectancia cada 10 nm de 260 a 650 nm de los tres pétalos. En las plantas de la undécima generación, un subconjunto de ca 20 plantas por repetición, se analizó el color, porque ninguno de los colores PCs se encuentran bajo selección durante todo el experimento. El área de la superficie del pétalo absorbente y reflectante ultravioleta se midió solo en planta de la generación 11 con una cámara digital sensible a los rayos ultravioleta con lente de cuarzo. Se tomaron fotografías de flores y se cuantificó el área absorbente ultravioleta utilizando el paquete de software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Ensayos de preferencia de polinizadores

Se realizaron ensayos de preferencias de polinizadores para cada réplica con ambos tipos de polinizadores. Para cada réplica, se realizaron dos ensayos conductuales (uno para cada tratamiento polinizador). Las plantas polinizadas por abejorros y moscas volantes (generación 11) de cada réplica se emparejaron aleatoriamente y se colocaron una al lado de la otra (aproximadamente 30 cm de distancia) en una jaula de vuelo (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m). Un polinizador fue colocado en la jaula y se le permitió visitar una planta. Los polinizadores fueron capturados inmediatamente después de hacer su elección. Cada par de plantas fue analizado con un polinizador.

Autocompatibilidad y autoformación autónoma

Para probar la autocompatibilidad, cultivamos plantas de la primera (15 plantas por réplica) y la undécima generación (30 plantas por réplica). Se cultivó una semilla por familia de semillas (de familias elegidas al azar)y dos flores por planta en antesis. Se utilizó el número medio de semillas producidas por flor autofloreciente para cada planta individual como medida de autocompatibilidad.

Para probar la autofecundación autónoma, cultivamos ca 12 plantas (una semilla por familia) por réplica de cada tratamiento de las generaciones 11 y 1 (en total 162 plantas). Después de 30 días, cuando se abrieron unas 20 flores, se cortaron cuidadosamente los cogollos restantes de cada planta y se registró el número de flores abiertas. A la planta se le permitió desarrollar frutos sin que ningún insecto accediera a las plantas. Después de la maduración de los frutos, se recolectaron semillas y se contó y pesó el número de semillas para cada planta. Se utilizó el número de frutos por flor abierta y de semillas por fruto como medida de autoformación autónoma. Debido a que algunas plantas tenían un número muy alto de frutos por flor abierta, eliminamos estos valores atípicos para la comparación final de autoformación autónoma. Se eliminó el siguiente número de valores atípicos: 1 en la generación 1; en G11: 2 en BB, 3 en HF, 2 en CO.

Análisis estadístico

Para analizar la selección fenotípica, se calcularon diferenciales de selección y gradientes a través de la regresión de la aptitud de la planta en traits61. Este análisis se realizó por separado para los tratamientos, pero para todas las réplicas y generaciones combinadas. Como estimación de aptitud, se utilizó el ‘número de visitas’, que fue una variable de conteo y siguió una distribución de Poisson. Otra variable de aptitud, el «conjunto relativo de semillas», tenía una distribución sesgada por los muchos valores cero; además, el conjunto de semillas omitió el único componente masculino de aptitud de la primera planta visitada, que no estableció las semillas de esta visita (porque los polinizadores inicialmente no llevaban polen de Brassica). Sin embargo, el número de visitas se correlacionó fuertemente con el conjunto de semillas relativo (BB: r626=0,694, P<0,001; HF: r605=0,597, P<0,001). Se utilizaron modelos lineales generalizados (con distribución de Poisson) para calcular gradientes de selección (multivariables) y diferenciales (univariables) para cada tratamiento con el número de visitas como variable dependiente y los rasgos como covariables. Además, se calcularon gradientes de selección cuadráticos con todos los rasgos y el término cuadrado de cada rasgo añadido al modelo, y posteriormente se duplicaron los gradientes 62. Para verificar las diferencias en la selección entre abejorros y moscas volantes, se realizó un modelo lineal generalizado (con distribución de Poisson) con el número de visitas como variable dependiente, el tratamiento como factor fijo, los rasgos de planta como covariables y el tratamiento de interacción*rasgo de planta. Antes del análisis de selección, todas las variables se estandarizaron para promediar=0 y d. s.=1 (valores Z) en el nivel replicado. También se utilizó un modelo lineal generalizado para comparar las tasas de visitas entre plantas polinizadas por abejorros y moscas volantes en todas las generaciones. Los valores del espectrofotómetro de color floral se redujeron mediante el análisis del componente principal (PC) con rotación varimax. En el análisis solo se utilizaron PC con un valor propio superior a uno.

El cambio evolutivo en los rasgos de las plantas se evaluó en plantas de la 11a generación utilizando análisis de función discriminante lineal multivariado y modelos lineales generales univariados (GLM). Para el GLM, se utilizó cada rasgo como variable dependiente, replicarse como factor aleatorio y el tratamiento como factor fijo con prueba post hoc de LSD. Para distinguir el impacto de la selección natural de la deriva, evaluamos si las diferencias de rasgos eran consistentes entre las réplicas de un tratamiento de polinización dado. En el análisis de GLM, un efecto de «tratamiento» significativo indica diferencia de rasgos entre diferentes grupos de polinizadores en todas las réplicas, y por lo tanto discrimina la evolución específica del polinizador de la deriva. La deriva se indicaría por cambios evolutivos en algunas réplicas (aleatorias) únicamente, indicados por un significado en el factor ‘replicar’ o interacción entre ‘replicar’ y ‘tratamiento’. La autocompatibilidad y el autoformado autónomo también fueron evaluados por GLM, pero los valores de las plantas de primera generación se incluyeron en el análisis. Para los análisis de volátiles y volumen de néctar, los datos se transformaron ln(1+x) para aproximarse a la distribución normal. Para el GLM con las variables de color, se realizó un análisis de PC como se describió anteriormente, pero sin estandarización previa de las variables. El análisis de CP se realizó para todos los tratamientos, réplicas y todas las generaciones juntas, resultando en cuatro PC que explicaron el 96,9% de la varianza total. La frecuencia de flores sin néctar se analizó por separado para cada generación, utilizando modelos lineales generalizados con distribución bimodal, con’ presencia de néctar ‘ (sí/no) como variable dependiente, y tratamiento y replicación como factores. Los rasgos en flores nectaríferas y sin néctar se compararon para la novena y la undécima generación juntas, utilizando modelos lineales generales con el rasgo como variable dependiente, y la ‘presencia de néctar’ y el tratamiento como factores fijos. Las preferencias de primera elección de abejorros y moscas volantes se analizaron mediante prueba binomial (prop de prueba=0,5; todas las réplicas agrupadas). Se calcularon correlaciones entre el néctar y los rasgos de la planta para todas las generaciones combinadas utilizando correlaciones producto-momento de Pearson con valores transformados en ln. Las estadísticas se realizaron con IMB SPSS Statistics (Versión 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

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