Was ist ein polyklonaler Antikörper?
Herstellung polyklonaler Antikörper
Ein polyklonaler Antikörper ist eine Sammlung von vielenimmunglobuline, die jeweils aus einem anderen B-Zell-Klon erzeugt werden. Diese Antikörper zielen auf verschiedene Epitope oder Bindungsstellen an einem einzelnen Antigen ab. Die Ableitung von multiplen B-Zell-Klonen und das anschließende Targeting mehrerer Epitope unterscheidet polyklonale Antikörper von monoklonalen Antikörpern.
Wie man polyklonale Antikörper herstellt
Jede Antikörpergeneration, polyklonal oder monoklonal, beginnt mit der Auslösung einer Immunantwort, die als Immunisierung bezeichnet wird. Die beabsichtigten Ziele werden in den Wirt injiziert, vom Immunsystem als fremd erkannt und von Antikörpern zur Immunblockade oder -clearance ins Visier genommen. Das Versagen, eine Immunantwort zu erzeugen, würde die Verwendung von Adjuvantien, immunogenen Substanzen wie Freund’s Adjuvans oder Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), erfordern, um die Immunrekrutierung weiter voranzutreiben. Die Immunisierung umfasst den Großteil dessen, was zur Herstellung polyklonaler Antikörper erforderlich ist. Eine typische Immunantwort wird unten beschrieben.
Die Herstellung von Antikörpern beginnt mit der Immunisierung
Anfängliche Exposition für eine erstklassige Immunantwort
Die anfängliche Exposition des Wirts gegenüber Antigen mit geeigneten Adjuvantien wird als „erstklassige“ Immunisierung bezeichnet. Typische Expositionsmethoden umfassen die Injektion in die Haut, das Peritoneum, die subkutane Schicht oder den Muskel. Weniger häufige Alternativen sind die orale und intranasale Verabreichung.Die DNA-Immunisierung ist auch eine aufstrebende Technologie für toxische oder anderweitig schwer zu produzierende Antigene. Jede nachfolgende Exposition gegenüber Antigen wird als „Boost“ -Immunisierung bezeichnet.
Antigenverarbeitung durch Antigen-präsentierende Zellen
Makrophagen, dendritische Zellen (DC) und in geringerem Maße B-Zellen, alle Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), internalisieren Antigen durch Endozytose oder Phagozytose. Die Antigenverarbeitung zerlegt das Antigen in kleinere Stücke, die dann an die Oberfläche des APC bewegt werden.
Stimulation von B-Zellen
Die Erkennung von Antigen auf der Oberfläche von APCs induziert die Freisetzung von stimulierenden Signalmolekülen, Zytokinen, aus Helfer-T-Zellen. Diese Zytokine aktivieren B-Zellen, die auch Antigen durch ihren B-Zell-Rezeptor (BCR) erkannt haben. Einige B-Zellen benötigen nach der BCR-Antigen-Interaktion keine Helfer-T-Zell-Aktivierung, was normalerweise eine schnellere Immunantwort mit Antikörpern mit geringerer Affinität hervorruft. Die Beteiligung von Helfer-T-Zellen ist entscheidend für eine vollständige Immunantwort sowie für die Regulierung der Selbsttoleranz.
Proliferation von B-Zellen und Antikörpersekretion
Aktivierte B-Zellen teilen sich, um sowohl Gedächtnis-B-Zell- als auch Plasmazellpopulationen zu erzeugen. Beide Zelltypen erkennen das gleiche Epitop. Plasmazellen sezernieren Antikörper in das Serum für die Immunerkennung, während Gedächtnis-B-Zellen für längere Zeit bestehen bleiben und eine schnelle Reaktion auf sekundäre Exposition des gleichen Antigens bieten.
Messung der Immunantwort
Die Messung der Antikörperspiegel während des Immunisierungsprozesses ist erforderlich, um den Fortschritt zu bewerten. AnELISA gegen Zielantigen vergleicht immunisierte Serumproben mit prä-immunisierten Serumproben, die den Grad der Immunantwort durch Immunisierung aufdecken. Serielle Verdünnungen von Proben bestimmen den Titer des Antikörpers. Typisch a 1:Ein Titer von 64.000 wird als robuste Immunantwort angesehen und reicht aus, um zur Serumernte oder Lymphozytenfusion überzugehen. Niedrigere Titer können nachfolgende Boost-Immunisierungen, alternative Verabreichungswege oder zusätzliche Adjuvantien erfordern.
Polyklonale Antikörper-Serumernte
Die Herstellung polyklonaler Antikörper erfordert lediglich die Gewinnung von Blut aus dem Wirtstier und die Trennung der Zellfraktion von der Serumfraktion, die sezernierte Antikörper enthält. Da viele antigenspezifische Antikörper von mehreren aktivierten B-Zellen sezerniert werden, enthält Blutserum die vielen Produkte verschiedener Antikörperklone, daher der Begriff polyklonaler Antikörper. Insbesondere wird die Erzeugung mehrerer klonaler Antikörper gegen ein Antigen sowohl durch die Verarbeitung des Antigens zu Fragmenten als auch durch jedes Fragment mit kleineren Regionen, sogenannten Epitopen, erreicht. Jeder kann jeweils durch spezifische BCR erkannt werden. Unterschiedliche B-Zell-Populationen sezernieren spezifische, aber unterschiedliche Antikörper gegen dasselbe Antigen. Darüber hinaus enthält Serum nicht nur Antikörper, die gegen das beabsichtigte Zielantigen gerichtet sind, sondern alle anderen Immunglobuline gegen andere Ziele, Arzneimittel, Hormone usw. diese befinden sich im Serum. Serum kann direkt als molekularbiologische Sonde verwendet werden, erfordert jedoch häufig eine weitere Reinigung, um die Empfindlichkeit und Spezifität eines bestimmten Assays zu erhöhen. Affinitätsreinigung erzielt Antikörperwiederaufnahme zu den unterschiedlichen Graden abhängig von der Technik, wie unten gezeigt, jedoch erreicht keine die Epitopniveauspezifität eines monoklonalen Antikörpers.
| Affinity Purification Technique | Pro | Con |
|---|---|---|
| Protein A/G | Simple, Cost effective | Recovers all immunoglobulin. |
| Antigen Specific | Recovers only antigen specific antibody. | Erfordert eine nicht triviale Menge an Antigen. |
Polyclonal Antibody Applications
| Application | Polyclonal AntibodyUse Rationale |
|---|---|
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ELISA Detection Antibody
(direct, indirect, sandwich, and capture ELISA formats) |
Binds multiple epitopes to deliver many detection molecules.
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ELISA Capture Antibody
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Polyreactivity can maximally recover antigen from samples.
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Western Blot
Detection Antibody |
Multiple epitope recognition can allow for antigen changes (denaturing/linearizing).
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Target recognized by many Ab for maximal drug delivery, immune recruitment, blocking, or activation.
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Klinische Tests
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Potenziell erhöhte Nachweiskapazität.
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