Versuchsplanung und Probenentnahme

Das Experiment wurde 1982 in Mengcheng County, Provinz Anhui, China (33 ° 13’N, 116 ° 35′ E, 42 m Höhe) mit typischem Kalkkonkretionsschwarzboden durchgeführt. Die Jahrestemperatur beträgt 14,8 ° C und der jährliche Niederschlag beträgt 872 mm. Fünf Düngungsbehandlungen mit Weizen-Soja-Fruchtfolge wurden in einem vollständig randomisierten Blockdesign mit vier Replikaten (jede Parzelle ist 70 m2) verglichen: (1) Kontrolle, Nichtdüngung; (2) NPK, NPK chemische Düngemittel bestehend aus Harnstoff (180 kg N ha−1 Jahr−1), Superphosphat (90 kg P2O5 ha−1 Jahr−1) und Kaliumchlorid (86 kg K2O ha− 1 y−1); (3) NPK + WS, NPK chemische Düngemittel plus 7500 kg Weizenstroh ha−1 Jahr−1; (4) NPK + PM, NPK chemische Düngemittel plus 15.000 kg frischer Schweinemist ha−1 Jahr−1; (5) NPK + CM, NPK chemische Düngemittel plus 30.000 kg frische Kuhdung ha−1 Jahr−1. Bei der NPK + WS-Behandlung wurde das gesamte Weizenstroh auf das Feld zurückgeführt, der Schweinemist in der NPK + PM-Behandlung und der Kuhdung in der NPK + CM hatten die ähnliche Menge an organischem Kohlenstoff wie das zugesetzte Weizenstroh. Darüber hinaus haben diese kontrastierenden Arten von Düngemitteln, die in unseren Düngungsbehandlungen enthalten sind, unterschiedliche Verfügbarkeitsgrade für Pflanzen und Mikroben, z. B. von labiler (Schweinemist) bis widerspenstiger (Weizenstroh und Kuhdung). Wir verwendeten eine breite Palette von Düngungsbehandlungen mit dem Ziel, unsere Ergebnisse repräsentativ und auf unsere Managementpraktiken anwendbar zu machen.

Wir haben die Weizengruppe (mit 30 bis 40 Weizenpflanzen während der Weizenfüllphase am 20.April 2017) umgraben, um die Wurzelsysteme so intakt wie möglich zu halten. Der Rhizosphärenboden, der fest an den Wurzeln haftete, wurde dann gebürstet. Gleichzeitig wurde der Mutterboden (0-15 cm tief) mit einem Schneckenbohrer (ca. 20 cm von den Pflanzen entfernt) als Schüttgut gesammelt. Der gesammelte Boden wurde durch ein 2-mm-Netz gesiebt, um die Verunreinigungen wie Wurzeln und Steine zu entfernen. Ein Teil des Bodens wurde für chemische Analysen bei 4 ° C gelagert, der Rest für die DNA−Extraktion bei – 40 ° C.

Bodenphysikochemische Analyse

Ein pH-Meter (FE20 FiveEasy™, Mettler Toledo, Deutschland) wurde verwendet, um den pH-Wert des Bodens bei einem Verhältnis von Boden zu destilliertem Wasser von 1:5 (Gewicht/Volumen) zu messen. Die Bodenfeuchte wurde gravimetrisch bestimmt, indem 5 g frischer Boden bei ca.105-108°C auf ein konstantes Gewicht getrocknet und anschließend das Gewichtsverhältnis (verdampftes Wasser zu getrocknetem Boden) berechnet wurde. Der Gesamtkohlenstoffgehalt (TC) und der Gesamtstickstoffgehalt (TN) des Bodens wurden durch Verbrennung von luftgetrocknetem Boden unter Verwendung eines CNS-2000-Analysators (LECO, St. Joseph, MI, USA) bestimmt, nachdem der Boden durch ein 0,15 mm-Netz gesiebt worden war. Der Gesamtphosphorgehalt (TP) und der Gesamtkaliumgehalt (TK) des Bodens wurden nach HF-HClO4-Aufschluss extrahiert und mit der Molybdänblau-Methode bzw. der Flammenspektrophotometrie-Methode (FP640, INASA, China) gemessen. Gelöster organischer Kohlenstoff (DOC) wurde durch Zugabe von 50 ml destilliertem Wasser zu 5 g frischer Erde, Schütteln für 1 h und Vakuumfiltration durch einen G4-Glasfaserfilter mit einem Porenraum von 1,2 µm (Fisher) extrahiert, und dann wurden die Kohlenstoffgehalte in den Extrakten durch einen Total Organic Carbon Analyzer (multi N /C 3000, Analytik Jena, Deutschland) bestimmt. Nitrat (NO3-N), Ammonium (NH4+-N) und gelöster Gesamtstickstoff (DTN) wurden im Verhältnis von 5 g frischer Erde zu 50 ml 2 M KCl extrahiert. Nach 1 h Shacking wurden die Extrakte durch einen G4-Glasfaserfilter mit einem Porenraum von 1,2 µm (Fisher) filtriert und anschließend mit einem Continuous Flow Analytical System (San++ System, Skalar, Holland) der Gehalt an NO3-N, NH4+-N und DTN analysiert. Gelöster organischer Stickstoff (DON) wurde nach folgender Formel berechnet: DON = DTN − NH4 + -N − NO3-N. Der verfügbare Phosphor (AP) im Boden wurde um 0 extrahiert.5 M NaHCO 3 und nach der Molybdänblau-Methode bestimmt. Verfügbares Kalium (AK) wurde mit 1 M Ammoniumacetat extrahiert und mittels Flammenphotometer (FP640, INASA, China) bestimmt (Zusatzdatei 3: Anhang 1).

Bestimmung der Stickstofffixierungsraten

Die 15N2-Markierungsmethode ist eine der gebräuchlichsten und am weitesten verbreiteten Methoden zur Messung der N-Fixierungsraten . Fünf Gramm Erde wurden in 18 × 150 mm Balchröhrchen gegeben, und der Kopfraum wurde durch synthetische Luft ersetzt, die 80% 15N2 und 20% O2 enthielt. Die Kontrollen wurden mit unmarkiertem N2-Gas gefüllt und parallel verarbeitet. Die Röhrchen wurden 22 Tage horizontal im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Atom % 15N von Bodenproben wurde mit einem stabilen Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (Flash 2000 HT/Conflo IV/Delta V, Thermo Fisher Scientific, Deutschland) bestimmt. Dann berechneten wir die Nettopotential-N-Fixierungsrate, indem wir die Differenz von insgesamt 15N in Böden, die 15N2 erhielten, relativ zur Kontrolle verglichen.

Hochdurchsatzsequenzierung und bioinformatische Analyse

Für die DNA-Extraktion, 0.5 g frische Erde wurden mit dem Fast DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA) verwendet. Die NIFH-Gene wurden mit Primerpaaren nifH-F/nifH-R (5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)/(5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′) amplifiziert. PCR-Reaktionen wurden in einer 20 µL-Reaktion durchgeführt, die 4 µL 5 × FastPfu-Puffer, 2 µL 2,5 mm dNTPs, 0,8 µL 5 µM Forward-Primer, 0,8 µL 5 µM Reverse-Primer, 0,4 µL fastPfu-Polymerase, 10 ng Template-DNA und doppelt destilliertes Wasser (ddH2O) enthielt. Die Amplifikation wurde bei 95 ° C für 3 min durchgeführt, mit 35 Zyklen von 95 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 45 s und Verlängerung bei 72 ° C für 10 min. PCR-Amplikons wurden mit einem Agarosegel-DNA-Reinigungskit (TaKaRa Bio) gereinigt, und dreifache PCR-Amplifikationen für jede Probe wurden durchgeführt und als PCR-Produkt zusammengefasst und dann auf der Plattform von Illumina MiSeq PE300 (Majorbio Company in Shanghai, China) sequenziert. Nach der Sequenzierung wurden die nifH-Nukleotidsequenzen unter Verwendung der QIIME-1.9.1-Pipeline (http://qiime.sourceforge.net/) analysiert. Zunächst wurden die minderwertigen Sequenzen (solche mit einem Qualitätsfaktor < 20, die mehrdeutige Nukleotide enthielten oder nicht mit Primer und Barcode übereinstimmten) entfernt und die verbleibenden Sequenzen wurden unter Verwendung der FunGene-Pipeline des Ribosomal Database-Projekts weiter in Aminosäuresequenzen umgewandelt . Die Sequenzen, die Proteine kodieren, die nicht mit der nifH-Proteinsequenz übereinstimmten oder Terminationscodons enthielten, wurden verworfen. Die verbleibenden Sequenzen wurden gegen die nifH-Gen-Datenbank ausgerichtet , wobei sowohl die fehlgeschlagenen als auch die chimären Sequenzen entfernt wurden. Die verbleibenden hochwertigen Sequenzen wurden in Operational Taxonomic Units (OTUs) mit einer Ähnlichkeit von 95% mit UCLUST im De-Novo-Modus gruppiert, und alle Singleton-OTUs wurden gelöscht.

Co-occurrency network analysis

Wir haben ein Co-occurrency Network mit allen Proben (Rhizosphäre und Schüttboden) aufgebaut und die wichtigsten ökologischen Cluster von stark assoziierten OTUs identifiziert. Die besten OTUs, die mehr als 80% der relativen Häufigkeit in der gesamten Gemeinschaft ausmachen, wurden ausgewählt . Alle paarweisen Spearman-Korrelationen zwischen OTUs wurden berechnet, und die Korrelationen mit einem Spearman-Koeffizienten von weniger als 0,65 und einem P-Wert von mehr als 0,01 wurden entfernt. Dies ermöglichte es uns, uns nur auf die OTUs zu konzentrieren, die stark zusammen auftraten und eher miteinander interagierten. Die Hauptmodule (ökologische Cluster) im Netzwerk wurden mit Gephi visualisiert (https://gephi.org/). Die relative Häufigkeit jedes ökologischen Clusters wurde berechnet, indem die standardisierten relativen Häufigkeiten (z-Score) der Arten, die zu ihm gehörten, gemittelt wurden (zusätzliche Datei 3: Anlage 3).

Statistische Analyse

ANOVA- und paarweise t-Tests wurden verwendet, um die Bodenvariablen, dominante mikrobielle Taxa und die mikrobielle Alpha-Diversität zwischen verschiedenen Düngungsbehandlungen zu vergleichen (Zusätzliche Datei 3: Anhang 1). Diese Tests wurden mit SPSS 21 implementiert. Mantel-Test wurde verwendet, um die Korrelationen zwischen der diazotrophen Gemeinschaft und den physikochemischen Eigenschaften zu analysieren (Zusätzliche Datei 3: Anhang 2). Dies wurde mit dem Paket „vegan“ in R × 32 (3.2.2) durchgeführt. Eine Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) wurde verwendet, um signifikante Unterschiede in den diazotrophen Gemeinschaften zwischen den Probenahmegruppen zu finden (Zusätzliche Datei 3: Anhang 2). Die PCoA wurde mit dem „labdsv“-Paket R × 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/) durchgeführt.

Phylogenetische Analysen

Das nifH-Gen liefert eine ausreichende phylogenetische Auflösung in ökologischen Studien. Der phylogenetische Baum für die 481 dominanten diazotrophen Phylotypen in den ökologischen Clustern wurde mit FastTree erstellt und mit GraPhlAn visualisiert . Die phylogenetische Stichprobentheorie kann analytisch eingesetzt werden (wobei die Zufallsstichprobe aus dem phylogenetischen Baum als vorhergesagte phylogenetische Diversität in einer lokalen Gemeinschaft angenommen wird und dann die beobachtete phylogenetische Diversität mit diesen Vorhersagen verglichen wird), um den Grad zu bestimmen, in dem die diazotrophe Gemeinschaft zufällig erscheint (zwischen − 2 und + 2), überstreut (über + 2) oder gruppiert (unter – 2). Die phylogenetische Stichprobentheorie wurde mit dem R-Paket „picante“ durchgeführt . Ein Vorteil der zufälligen Stichprobe des regionalen phylogenetischen Baums besteht darin, dass er verwendet werden kann, um Stichproben ungleicher Größe basierend auf dem binomialen Stichprobenmodell zu vergleichen . Die Unterschiede zwischen beobachteter und erwarteter phylogenetischer Diversität wurden durch Berechnung und Vergleich von Z-Scores für jeden ökologischen Cluster bestimmt. Wenn die beobachtete phylogenetische Diversität geringer ist als die erwartete Diversität (unter − 2), wird die mikrobielle Gemeinschaft im ökologischen Cluster als phylogenetisch gruppiert angesehen, was bedeutet, dass eng verwandte Taxa eher von der Umwelt beprobt und aktiv ausgewählt werden .

Strukturgleichungsmodellierungsanalyse

Das REM wurde mit IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation) durchgeführt. Es wurde verwendet, um die direkten und indirekten Auswirkungen der physikochemischen Eigenschaften des Bodens und der relativen Häufigkeit der wichtigsten ökologischen Cluster auf die N-Fixierungsraten zu bewerten. Die physiochemischen Eigenschaften des Bodens umfassten den pH-Wert des Bodens, Gesamtkohlenstoff, Gesamtstickstoff und Gesamtphosphor. Im Modell waren die Behandlungen (Kontrolle, NPK, NPK + WS, NPK + PM und NPK + CM) kategoriale Variablen mit zwei Ebenen: 1 (eine bestimmte Behandlung) und 0 (verbleibende Behandlungen). Darüber hinaus wurde Bootstrapping verwendet, um die Wahrscheinlichkeit zu testen, dass sich Pfadkoeffizienten von Null unterschieden, da einige der Variablen nicht normalverteilt waren. Wir berechneten auch die standardisierten Gesamteffekte (STES) der Bodeneigenschaften, Düngungsbehandlungen und des Rhizosphäreneffekts auf die N-Fixierungsrate, um die Interpretation des SEM zu erleichtern.

Random Forest Modeling analysis

Random Forest Regression (R-Paket „randomForest“) wurde verwendet, um die normalisierten OTUs in verschiedenen Behandlungen zurückzubilden. Die 10-fache Kreuzvalidierungsmethode wurde verwendet, um den optimalen Satz von OTUs zu bestimmen, der mit den N-Fixierungsraten korrelierte . Ranglisten von OTUs in der Reihenfolge der randomisierten gemeldeten Merkmalswichtigkeitswerte wurden basierend auf dem Anstieg des mittleren quadratischen Fehlers der Stickstofffixierungsraten erreicht, der über 100 Iterationen des Algorithmus vorhergesagt wurde. Die 50 Marker-OTUs wurden auf der Grundlage der minimalen durchschnittlichen Kreuzvalidierungs-Mittelwert-Quadrat-Fehler ausgewählt, die aus fünf Versuchen der 10-fachen Kreuzvalidierung erhalten wurden.