Experimentelles Design- und Studiensystem

Im Jahr 2012 wurden 300 Samen von schnell wachsenden Brassica rapa-Pflanzen (Wisconsin Fast Plants Standard Seed, mit hoher genetischer Variation) von Carolina Biological Supplies gewonnen und in einem Phytotron unter standardisierten Boden-, Licht- und Bewässerungsbedingungen gezüchtet. Diese Pflanzen sind vollständig auskreuzend (selbstkompatibel) und weisen genügend genetische Variation auf, um leicht auf Selektion zu reagieren58,59. Aus diesen 300 Pflanzen wurden 108 vollständige Sib-Samenfamilien durch künstliche Kreuzungen erzeugt (nur Samenfamilien aus Kreuzungen, bei denen beide Elternteile Früchte produzierten, wurden verwendet). Diese 108 vollständigen Sib-Samenfamilien wurden als Ausgangspopulation für das Experiment verwendet.

Für die erste Generation des Experiments wurden drei Behandlungsgruppen unter Verwendung der 108 Familien eingerichtet, so dass jede Familie in jeder Behandlung vertreten war, um den Genotyp unter den Behandlungen zu kontrollieren (Ergänzende Abb. 1). Jede Behandlung bestand daher aus 108 Pflanzen (die 108 Samenfamilien repräsentierten), die wir in drei Replikate (A, B, C) mit jeweils 36 Pflanzen unterteilt haben. Die Replikate innerhalb der Behandlungen wurden während 9 Generationen als isolierte Linien gehalten (es wurden keine Kreuzungen zwischen Replikaten durchgeführt), um unabhängige, wiederholbare evolutionäre Veränderungen beurteilen zu können. Die Pflanzen aller Replikate in allen Behandlungen wurden im Phytotron unter standardisierten Boden- (Einheitserde classic), Licht- (24 h Licht) und Bewässerungsbedingungen gezüchtet. Alle Pflanzen wurden ab Generation 1 in jeder zweiten Generation phänotypisiert. Blumenduftdaten der Generationen 1 und 3 gingen aufgrund technischer Probleme verloren; Stattdessen wurde Duft von Generation 4 gesammelt. Florale Duftdaten der Generation 1 wurden nach dem Ende des Experiments erhalten, indem Pflanzen aus der Startgeneration nachgezüchtet und Duft von jeweils einer Pflanze aus jeder der 108 Samenfamilien gesammelt wurden. So wurden von der ersten Generation insgesamt 108 Pflanzen (36 von jedem Replikat) gleichzeitig mit Pflanzen der Generation 9 auf Blütenduft untersucht.

Experimentelle Evolution und Bestäubungsbehandlungen

In unserer Studie verwendeten wir drei Bestäuberbehandlungen: Hummeln (‚BB‘, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Schweiz), Schwebfliegen (‚HF‘, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Deutschland) und Handbestäubung. Beide Insekten besuchen gerne Blüten vieler Brassicaceae-Arten in der Natur, repräsentieren jedoch unterschiedliche funktionelle Bestäubungskategorien und variieren nachweislich in ihrer Häufigkeit in natürlichen Lebensräumen 46. Die Verwendung einzelner Bestäuberarten ahmt Bestäuberumgebungen nach, in denen sich die am häufigsten vorkommenden Bestäuber funktionell unterscheiden. Bei der Kontrollbehandlung (‚CO‘) wurden zufällig ausgewählte Pflanzen von Hand kreuzbestäubt.

Die Bestäubung erfolgte 23 Tage nach Aussaat in einem Flugkäfig (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) im Gewächshaus unter standardisierten Lichtverhältnissen mit Hummeln und Schwebfliegen. Experimente wurden zwischen 0900 Stunden und 1.500 Stunden durchgeführt. Hummeln wurden in einem separaten Flugkäfig im Gewächshaus gehalten. Schwebfliegen wurden als Puppen gekauft und bis zum Schlüpfen aufgezogen, wonach männliche und weibliche Fliegen getrennt wurden. Die Bestäuber durften bis 3 Tage vor der Bestäubungsbehandlung an schnell cyclisierenden B. rapa-Pflanzen (Pflanzen der Kontrollgruppe der jeweiligen Generation) fressen und mit zusätzlichem Pollen gefüttert werden; danach wurden nur noch Pollen und Zuckerlösung bereitgestellt; 16 h. vor der Bestäubung wurden die Bestäuber ausgehungert.

Zur Bestäubung wurden alle Pflanzen eines Replikats zufällig in einem Quadrat von 6 × 6 Pflanzen mit einem Abstand von 20 cm voneinander im Flugkäfig platziert. Fünf Bestäuber wurden einzeln und nacheinander hinzugefügt und jedes Insekt durfte maximal drei verschiedene Pflanzen besuchen und dann aus dem Käfig entfernt werden; Jedes Insekt wurde nur einmal verwendet. Insgesamt erhielten 12-15 Pflanzen pro Replikat einen oder mehrere Besuche von Bestäubern. Die Gesamtdurchschnittszahl (± s.d.) der Besuche (in besuchten Pflanzen) betrug 1,35 ± 0,63 für hummelbestäubte Pflanzen und 1,28 ± 0,53 für schwebfliegenbestäubte Pflanzen. Für die besuchten Pflanzen wurden die Anzahl der Besuche und die Anzahl der besuchten Blumen aufgezeichnet. In der Kontrollgruppe wurden 12 Pflanzen zufällig pro Replikat ausgewählt und 5 Blüten jeder Pflanze wurden von einer zufällig ausgewählten Vaterpflanze von Hand bestäubt; Väter wurden aus denselben 12 Pflanzen ausgewählt. Jede Pflanze konnte Pollenspender für mehr als eine Pflanze sein, erhielt aber nur Pollen von einer Pflanze. Nach der Bestäubung wurden die Blüten markiert und die Pflanzen weitere 30 Tage in einem Käfig gehalten, bis die Früchte gesammelt waren. Die Samen wurden gezählt und der relative Samensatz wurde für jede Pflanze berechnet, indem der einzelne Samensatz durch den mittleren Samensatz im Replikat dividiert wurde. Zusätzlich wurde die Anzahl der Samen pro Frucht für jede besuchte Pflanze berechnet. Für jede Pflanze wurde die männliche Fitness als vorhergesagte Vaterschaft (Anzahl der Pollenexportereignisse) geschätzt.

Von allen Samen, die von den bestäubten Blüten produziert wurden, wurde eine Teilmenge von Samen verwendet, die für die Samenproduktion jedes Individuums repräsentativ waren, um die nächste Generation zu züchten. Je mehr Samen eine Pflanze produzierte, desto mehr Samen trug sie zur nächsten Generation bei, die wiederum aus 36 Pflanzen für jedes Replikat bestand. Der Samenbeitrag jeder besuchten Pflanze in die nächste Generation wurde für jedes Replikat berechnet als: 36 / (Summe der Samen / einzelner Samensatz replizieren). Werte unter 0,5 wurden auf 1 gerundet.

Inzuchtdepression

Die Inzuchtdepression während des gesamten Experiments wurde durch Messung des Samengewichts und der Keimrate quantifiziert, letztere als Prozentsatz der pro Replikat gekeimten Samen. Zur Kontrolle für die trait-Veränderungen aufgrund von Inzucht depression, Samen von Pflanzen produziert der 9. generation angebaut wurden (repräsentiert die 10th generation) und manuell überquert zwischen den Wiederholungen innerhalb der Behandlungen, so dass Pflanzen, die jeder replizieren, wurden die pollen-Spender und pollen Empfänger für das Pflanzen von zwei verschiedenen repliziert (♀A-♂C, ♀B-♂A, ♀C-♂B). Kreuzungen innerhalb dieser Kombinationen von Replikaten waren zufällig. Von den resultierenden Samen (der elften Generation) wurde ein Individuum pro Samenfamilie (36 Pflanzen pro Replikat) unter den gleichen Bedingungen wie während des Experiments gezüchtet. Von diesen Interreplikatkreuzungen wurden die Merkmale erneut gemessen und für den endgültigen Vergleich der Merkmale zwischen den Behandlungsgruppen verwendet.

Pflanzenmerkmale

Die meisten Merkmale, einschließlich Blumenduft, wurden vor der Bestäubung, 19-21 Tage nach der Aussaat gemessen. Blütenblattbreite, Länge, Stempellänge und Blütendurchmesser von drei zufällig ausgewählten Blüten pro Pflanze wurden mit einem elektronischen Messschieber (Digital Caliper 0-150 mm, TOOLCRAFT) gemessen. Nektar aus drei Blüten wurde mit 1 µl Mikrokapillarröhrchen (Blaubrand, Wertheim, Deutschland) gesammelt und das Volumen durch Messen der Länge der Nektarsäule in der Mikropipette mit einem Messschieber bestimmt. Zur Quantifizierung wurde der Mittelwert von drei Blüten verwendet. Für 157 gleichmäßig über die Behandlungen verteilte Pflanzen wurde der Zuckergehalt des Nektars mittels Derivatisierung und gaschromatographischer Analyse bestimmt. Dazu wurde Nektar auf Filterpapier übertragen, das in Kieselgel gelagert war. Der den Nektar enthaltende Sektor auf dem Filterpapier wurde vom restlichen Filterpapier abgetrennt und Nektar in 1 ml hochreinem Mili-Q-Wasser durch Schütteln der Verdünnung für 90 min mit 400 upm bei 60°C auf einem Laborschüttler eluiert. Anschließend wurden 50 µl der Lösung bei 60°C getrocknet und mit 100 µl einer Mischung aus wasserfreiem Pyridin (Fisher Scientific, Geel, Belgien), Hexamethylsilazan (Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz) und Trimethylchlorsilan (Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz) (10:5:3) derivatisiert. Anschließend wurden die Proben mittels GC-MS wie in Ref. 32. Wir berechneten die Gesamtzuckermengen pro Blüte und Blütenstand als Summe aller verschiedenen Zucker (Fructose, Glucose, Saccharose und Sorbit). Die Korrelation zwischen Nektarzuckergehalt und Nektarvolumen war positiv und hoch (r156=0,732, P<0,001), so dass für die übrigen Pflanzen nur das Nektarvolumen bestimmt wurde. Die Blütenduftsammlung wurde vor Bioassays zerstörungsfrei von allen Pflanzenblütenständen durchgeführt, sobald mindestens fünf Blüten offen waren. Wir verwendeten Headspace-Sorption mit einem Push-Pull-System59,60. Die Blütenstände der Pflanzen wurden in zuvor mit Sigmacote (Sigma-Aldrich) beschichteten Glaszylindern eingeschlossen und mit einer Teflonplatte verschlossen. Die Anzahl der offenen Blüten wurde für jede Pflanze gezählt. Luft aus der Umgebung wurde mit einem Durchfluss von 100 ml min−1 Trog Aktivkohlefilter in den Glaszylinder gedrückt. Gleichzeitig wurde Luft aus dem Glaszylinder mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 150 ml min−1 durch ein mit ∼30 mg Tenax TA (60/80 mesh; Supleco, Bellefonte, PA, USA) gefülltes Glasrohr gezogen. Luft aus leeren Glaszylindern wurde als Luftstrom gesammelt. Florale flüchtige Stoffe wurden für zwei Stunden in einem Phytotron unter standardisierten Licht- und Temperaturbedingungen gesammelt. Die Quantifizierung von flüchtigen Bestandteilen erfolgte durch Gaschromatographie mit massenselektiver Detektion (GC-MSD). Die Proben wurden in einen GC (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) mittels eines MultiPurpose Samplers (MPS; Gerstel, Müllheim, Deutschland) unter Verwendung einer Gerstel thermal desorption unit (TDU; Gerstel) mit einem cold injection System (CIS; Gerstel) injiziert. Zur Thermodesorption wurde die TDU mit einer Geschwindigkeit von 60°C min−1 von 30 auf 240°C erwärmt und 1 min auf einer Endtemperatur gehalten. Die CIS wurde beim Einfangen von eluierenden Verbindungen aus der TDU auf -150°C eingestellt. Zur Injektion wurde das CIS mit einer Geschwindigkeit von 12 ° C s−1 auf 250 ° C erhitzt und die Endtemperatur für 3 min gehalten. Der GC wurde mit einer HP-5−Säule (0,25 mm Durchmesser, 0,25 µm Filmdicke, 15 m Länge) bestückt und Helium als Trägergas mit einer Flussrate von 2 ml min-1 verwendet. Die Identifizierung und Quantifizierung der Verbindungen erfolgte folgend60 mit dem Agilent MSD ChemStation-Programm. Die Quantifizierung von Verbindungen wurde durch Messung von Peakbereichen ausgewählter Zielionen erhalten, die für die einzelnen Duftverbindungen spezifisch sind. Spezifische Zielionen wurden aus synthetischen Standards aller Verbindungen erhalten; Peakbereiche wurden unter Verwendung von Kalibrierungskurven, die zuvor für jede Verbindung unter Verwendung synthetischer Verbindungen in drei verschiedenen Konzentrationen erhalten wurden, in absolute Mengen umgewandelt. Nur Duftstoffe, die in signifikant höheren Mengen als in der Luftkontrolle vorhanden waren, wurden in die Analyse einbezogen (insgesamt 14 Duftstoffe). Alle Mengen an flüchtigen Bestandteilen wurden in pg pro 1 l−1 Probenluft berechnet.

Dreiundzwanzig Tage nach der Aussaat, am selben Tag wie die Bestäubung, wurden die Anzahl der offenen Blüten und die Höhe jeder Pflanze aufgezeichnet. Nach der Bestäubung (jedoch am selben Tag) wurden die Farbreflexionsspektren von drei Blütenblättern von verschiedenen (wenn möglich) nicht bestäubten Blüten pro Pflanze mit einem faseroptischen Spektralphotometer (AvaSpec-2048) aufgezeichnet; Avantes, Apeldoorn, Niederlande) und eine Xenon-Pulslichtquelle (AvaLight-XE; Avantes). Ein Blütenblatt nach dem anderen wurde unter das Spektralphotometer gelegt (speziell auf den distalen Teil des Blütenblatts fokussiert) und der prozentuale Reflexionsgrad (relativ zu einem weißen Standard) zwischen 200 und 900 nm alle 0,6 nm wurde im Transmissionsmodus aufgezeichnet. Von dem gemessenen Spektrum wurden nur die Mittelwerte der Remissionswerte alle 10 nm von 260 bis 650 nm aus den drei Blütenblättern in die Analyse verwendet. Bei Pflanzen der elften Generation wurde eine Teilmenge von ca. 20 Pflanzen pro Replikat auf Farbe analysiert, da während des gesamten Experiments keine der Farb-PCs selektiert wurde. Die Fläche der ultraviolett absorbierenden und reflektierenden Blütenblattoberfläche wurde nur in Pflanzen der Generation 11 mit einer ultraviolettempfindlichen Digitalkamera mit Quarzlinse gemessen. Mit dem Softwarepaket ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/) wurden Bilder von Blumen aufgenommen und die ultraviolett absorbierende Fläche quantifiziert.

Bestäuberpräferenz-Assays

Assays für Bestäuberpräferenzen wurden für jedes Replikat mit beiden Bestäubertypen durchgeführt. Für jedes Replikat wurden zwei Verhaltenstests durchgeführt (einer für jede Bestäuberbehandlung). Bumblebee- und Hoverfly-bestäubte Pflanzen (Generation 11) jedes Replikats wurden zufällig gepaart und nebeneinander (ca. 30 cm Abstand) in einem Flugkäfig (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) platziert. Ein Bestäuber wurde in den Käfig gelegt und durfte eine Pflanze besuchen. Bestäuber wurden sofort gefangen, nachdem sie ihre Wahl getroffen hatten. Jedes Pflanzenpaar wurde mit einem Bestäuber untersucht.

Selbstkompatibilität und autonomes Selfing

Um die Selbstkompatibilität zu testen, züchteten wir Pflanzen der ersten (15 Pflanzen pro Replikat) und der elften Generation (30 Pflanzen pro Replikat). Ein Samen pro Samenfamilie (aus zufällig ausgewählten Familien) wurde gezüchtet und zwei Blüten pro Pflanze bei Anthesis selfed. Die mittlere Anzahl der produzierten Samen pro selbstblühender Blume für jede einzelne Pflanze wurde als Maß für die Selbstverträglichkeit verwendet.

Um das autonome Selfing zu testen, züchteten wir ca. 12 Pflanzen (ein Samen pro Familie) pro Replikat aus jeder Behandlung der Generation 11 und 1 (insgesamt 162 Pflanzen). Nach 30 Tagen, in denen sich ca. 20 Blüten geöffnet hatten, wurden die verbleibenden Knospen in jeder Pflanze sorgfältig geschnitten und die Anzahl der geöffneten Blüten aufgezeichnet. Die Pflanze durfte dann Früchte entwickeln, ohne dass Insekten Zugang zu den Pflanzen hatten. Nach der Reifung der Früchte wurden Samen gesammelt und die Anzahl der Samen für jede Pflanze gezählt und gewogen. Die Anzahl der Früchte pro offener Blüte und der Samen pro Frucht wurden als Maß für die autonome Selbstbildung verwendet. Da einige Pflanzen eine sehr hohe Anzahl von Früchten pro offener Blüte aufwiesen, haben wir diese Ausreißer für den endgültigen Vergleich der autonomen Selfing gelöscht. Die folgende Anzahl von Ausreißern wurde gestrichen: 1 in Generation 1; in G11: 2 in BB, 3 in HF, 2 in CO.

Statistische Analyse

Um die phänotypische Selektion zu analysieren, wurden Selektionsdifferentiale und Gradienten berechnet, indem die Pflanzenfitness auf Merkmale zurückgeführt61. Diese Analyse wurde separat für die Behandlungen durchgeführt, aber für alle Replikate und Generationen kombiniert. Als Fitnessschätzung wurde die ‚Anzahl der Besuche‘ verwendet, die eine Zählvariable war und einer Poisson-Verteilung folgte. Eine andere Fitnessvariable, ‚relative Seed Set‘, hatte eine Verteilung, die durch die vielen Nullwerte voreingenommen war; Außerdem verpasste Seed Set die einzige männliche Fitnesskomponente der ersten besuchten Pflanze, die bei diesem Besuch keinen Samen setzte (weil Bestäuber anfangs keinen Brassica-Pollen trugen). Die Anzahl der Besuche korrelierte jedoch stark mit dem relativen Seed-Set (BB: r626=0,694, P<0,001; HF: r605=0,597, P<0,001). Verallgemeinerte lineare Modelle (mit Poisson-Verteilung) wurden verwendet, um Selektionsgradienten (multivariat) und Differentiale (univariat) für jede Behandlung mit Anzahl der Besuche als abhängige Variable und Merkmale als Kovariaten zu berechnen. Darüber hinaus wurden quadratische Auswahlgradienten berechnet, wobei alle Merkmale und der quadratische Term jedes Merkmals dem Modell hinzugefügt und anschließend die Gradienten verdoppelt wurden62. Um Unterschiede in der Selektion zwischen Hummeln und Schwebfliegen zu überprüfen, wurde ein verallgemeinertes lineares Modell (mit Poisson-Verteilung) mit der Anzahl der Besuche als abhängige Variable, der Behandlung als fester Faktor, den Pflanzenmerkmalen als Kovariaten und der Interaktionsbehandlung * Pflanzenmerkmal durchgeführt. Vor der Selektionsanalyse wurden alle Variablen auf Replikatebene auf Mittelwert=0 und s.d.=1 (Z-Werte) standardisiert. Ein verallgemeinertes lineares Modell wurde auch verwendet, um Besuchsraten zwischen Hummel- und schwebfliegenbestäubten Pflanzen über alle Generationen hinweg zu vergleichen. Die Farbspektralphotometerwerte wurden durch Hauptkomponentenanalyse (PC) mit Varimax-Rotation reduziert. Nur PCs mit einem Eigenwert über eins wurden in der Analyse verwendet.

Die evolutionäre Veränderung von Pflanzenmerkmalen wurde in Pflanzen der 11. Generation mittels multivariater linearer Diskriminanzfunktionsanalyse und univariaten allgemeinen linearen Modellen (GLM) untersucht. Für GLM wurde jedes Merkmal als abhängige Variable verwendet, als Zufallsfaktor repliziert und als fester Faktor mit LSD-Post-hoc-Test behandelt. Um die Auswirkungen der natürlichen Selektion von der Drift zu unterscheiden, untersuchten wir, ob Merkmalsunterschiede zwischen Replikaten einer bestimmten Bestäubungsbehandlung konsistent waren. In der GLM-Analyse weist ein signifikanter Behandlungseffekt auf Merkmalsunterschiede zwischen verschiedenen Bestäubergruppen über alle Replikate hinweg hin und unterscheidet somit die bestäuberspezifische Evolution von der Drift. Drift würde nur durch evolutionäre Veränderungen in einigen (zufälligen) Replikaten angezeigt, angezeigt durch eine Signifikanz des Faktors ‚Replizieren‘ oder Interaktion zwischen ‚Replizieren‘ und ‚Behandlung‘. Selbstverträglichkeit und autonomes Selfing wurden ebenfalls von GLM bewertet, aber auch Werte von Anlagen der ersten Generation wurden in die Analyse einbezogen. Für die Analysen von flüchtigen Stoffen und Nektarvolumen wurden die Daten ln (1 + x) transformiert, um sich der Normalverteilung anzunähern. Für das GLM mit den Farbvariablen wurde eine PC-Analyse wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch ohne vorherige Standardisierung der Variablen. Die PC-Analyse wurde für alle Behandlungen, Replikate und alle Generationen zusammen durchgeführt, was zu vier PCs führte, die 96,9% der Gesamtvarianz erklärten. Die Häufigkeit nektarloser Blüten wurde für jede Generation separat analysiert, indem verallgemeinerte lineare Modelle mit bimodaler Verteilung verwendet wurden, wobei das Vorhandensein von Nektar (ja / Nein) als abhängige Variable und Behandlung und Replikation als Faktoren verwendet wurden. Merkmale in nektarhaltigen und nektarlosen Blüten wurden für die neunte und elfte Generation miteinander verglichen, indem allgemeine lineare Modelle mit dem Merkmal als abhängige Variable und ‚Vorhandensein von Nektar‘ und Behandlung als feste Faktoren verwendet wurden. Die First Choice Präferenzen von Hummeln und Schwebfliegen wurden mittels Binomialtest analysiert (test-prop=0,5; alle Replikate gepoolt). Korrelationen zwischen Nektar und Pflanzenmerkmalen wurden für alle Generationen unter Verwendung von Pearson-Produkt-Moment-Korrelationen mit ln-transformierten Werten berechnet. Statistiken wurden mit IMB SPSS Statistics (Version 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/) durchgeführt.

Datenverfügbarkeit