Einführung

Die familiäre Multiple Lipomatose (FML, OMIM% 151.900) ist eine seltene autosomal dominante Erkrankung der Unterhaut, die durch die Entwicklung gut eingekapselter subkutaner Knötchen an Extremitäten und Rumpf gekennzeichnet ist.1 Erste Berichte über multiple adipozytäre Tumoren wurden seit 1846 von Sir Benjamin Brodie gemacht.2 Spätere Ergebnisse von Blaschko (1891) und Alsberg (1892) zeigten ein familiäres Wiederauftreten der Läsionen und beobachteten eine erhöhte Inzidenz bei Männern.1,3,4 In den folgenden Jahren veröffentlichten viele andere Autoren Familien mit Merkmalen, die stark auf FML hindeuteten,1,5,6, und schließlich klassifizierte Das Gupta 1970 lipomatöse Tumoren in drei Kategorien: solitär oder sporadisch, FML und Multiple Symmetrische Lipomatose (MSL).7,8

Solitäre Lipome gelten als die häufigste gutartige Neubildung von Weichteilen bei Erwachsenen, aber multiple Lipome treten bei 5% der Individuen auf.9,10 Die genaue Prävalenz von FML ist unbekannt, wurde jedoch auf 0,002% geschätzt.8,11,12 Der Altersbeginn der Knötchen liegt zwischen 30 und 40 Jahren und erreicht den maximalen Höhepunkt in den 50er Jahren.6,8,13,14 Es ist allgemein angenommen worden, dass diese Störung eine Präferenz für Männer aufweist, eine große Anzahl von Arbeiten zeigt jedoch, dass beide Geschlechter gleichermaßen betroffen sind.15-17 Obwohl es sich um eine gutartige Erkrankung handelt, können bei einigen Personen kosmetische Bedenken auftreten, die ihre Lebensqualität beeinträchtigen. Darüber hinaus ist es auch bei übergewichtigen Personen weit verbreitet.9

Bisher konzentrierte sich die verfügbare Forschung in der FML explizit auf klinische Aspekte, und molekulare Fragen werden normalerweise nicht untersucht. Die Literatur legt nahe, dass mindestens 70% der sporadischen Lipome auf zytogenetische Umlagerungen der 12q13-15-Bande zurückzuführen sind, die zu einer deregulierten Expression des HMGA2-Gens (High Mobility Group AT-hook 2) führen könnten. Dieses Gen kodiert Nicht-Histone Chromatin-Proteine, die für DNA-Konformationsänderungen, aberrante Zellproliferation und Entwicklung von gutartigen mesenchymalen Tumoren verantwortlich sind.18-20

Das Erkennen der molekularen Basis genetischer Bedingungen und die Implementierung von Hochdurchsatzsequenzierungstechnologien haben es ermöglicht, andere Mechanismen zu erforschen und aufzuklären, die an der Ätiologie mehrerer Genodermatosen beteiligt sind. Daher zielte diese Studie darauf ab, eine klinische und molekulare Charakterisierung von sieben Personen mit FML durchzuführen, um Varianten in sechs Kandidatengenen im Zusammenhang mit Lipomatose unter Verwendung von Sanger- und Next-Generation-Sequenzierungstechniken (NGS) nachzuweisen.

Materialien und Methoden

Patienten und ethische Aspekte

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki durchgeführt. Die Genehmigung wurde vor der Studie vom Institutional Review Board eingeholt (Die Forschungsethikkommission bei FCM-UNICAMP, Datei N ° 1.313.164) und alle Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Wir führten die Studie in der Ambulanz für medizinische Genetik am Klinischen Krankenhaus der Universität von Campinas (HC-UNICAMP) in São Paulo, Brasilien, durch. Insgesamt waren sieben Personen, die fünf unabhängigen Familien angehörten (von A bis E genannt), teilnahmeberechtigt. Primäre Einschlusskriterien für die Auswahl der Probanden waren wie folgt: i) Alter über 18 Jahre, ii) klinische und histopathologische Diagnose von Lipomen oder Angiolipomen und iii) familiäres Wiederauftreten, was auf eine autosomal dominante Vererbung hindeutet. Die wichtigsten klinischen Aspekte wurden in strukturierter Form aus Krankenakten gesammelt. Die körperliche Untersuchung beinhaltete die Teilnahme von Dermatologen und Genetikern. Die Pathologieabteilung von HC-UNICAMP stellte die histopathologischen Proben zur Verfügung. Die klinischen Befunde sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1 Klinische Zusammenfassung von Patienten mit FML

Sanger-Sequenzierung des HMGA2-Gens

Genomische DNA wurde aus peripheren EDTA-Blutproben von sieben Patienten nach dem von Sambrook et al.verwendeten konventionellen Phenol-Chloroform-Verfahren extrahiert21

Es wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt, um fünf kodierende Exons und Intron-Exon knotenpunkte Regionen der HMGA2 gen. Mit zwei bioinformatischen Online-Tools, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) und OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), entwarfen wir das spezifische Primerpaar, wie in Tabelle 2 zusammengefasst.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies®) nach den Anweisungen des Herstellers. Chromatogramme wurden mit Chromas v.2.6.5 untersucht. Die Ergebnisse wurden mit der HMGA2 Ensembl-Transkriptnummer ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html) verglichen. Wir überprüften die neuartigen Varianten in drei öffentlichen Datensätzen: i) Dem Global Alliance for Genomics and Health (GA4GH) Beacon Network (https://beacon-network.org/#/), ii) Dem Exome Aggregation Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) und iii) Online-Archiv brasilianischer Mutationen (http://abraom.ib.usp.br/). Um die Pathogenitätswerte und Schädigungseffekte neuartiger Varianten im Kandidaten-HMGA2-Gen zu bewerten, verwendeten wir verschiedene In-silico-Vorhersagemodelle wie VEP (Variant Effect Predictor),22 FATHMM (Functional Analysis Through Hidden Markov Models),23 UMD-predictor,24 SIFT (Sorting Intolerant from Tolerant),25 PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer),26 und Mutation Taster.27

Target Multi-Gene Panel

Ein benutzerdefiniertes Panel wurde durchgeführt, um die an der syndromischen Lipomatose beteiligten Gene zu bewerten. Um diese Technik durchzuführen, erhielten wir genomische DNA aus Speichelproben von fünf Patienten (A, B, C, D und E) mit dem Oragene® DNA Self-Collection Kit (DNA Genotek, Inc., Ottawa, Ontario, Kanada). Anschließend wurden Proben angereichert und gegen zielspezifische Sequenzen hybridisiert. Die Aufnahme erfolgte mit dem Illumina® MiSeq (TruSeq Capture) Sequenzer der nächsten Generation im 150bp Paired-End-Modus gemäß dem Standardprotokoll für diese Plattform. Die Bedeckungstiefe der Zielregionen war höher als 50x. Die Anreicherung und Analyse konzentrierte sich auf die kodierenden Sequenzen von fünf Transkripten (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038.5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2 und PTEN NM_000314.4), 10bp von intronischen Sequenzen und anderen Regionen, die vermutlich krankheitserregend sind. Exonische Deletionen, Duplikationen und Spleißstellenvariationen wurden während der Untersuchung ebenfalls berücksichtigt. Die Lesevorgänge wurden ausgerichtet und mit der Referenz des menschlichen Genoms (GRCh37) verglichen. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) wurde gewählt, um Varianten zu validieren, wie von Invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #) erwähnt.

Datenverfügbarkeit

Sequenzen wurden bei der GenBank eingereicht (Zugangsnummer: BankIt2217069 Seq1 -MK875826). Datensätze zu diesem Artikel sind beim Europäischen Bioinformatik-Institut EMBL-EBI über das ENA Repository mit der Studienzugangsnummer PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena) verfügbar.

Ergebnisse

Klinische Analyse

Sieben Personen aus fünf unabhängigen Familien (A, B1, B2, C, D1, D2 und E) wurden eingeschlossen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Wir haben keine elterliche Blutsverwandtschaft zwischen den Teilnehmern identifiziert. Die ethnische Herkunft wurde von jedem Probanden als gemischt gemeldet. In einer allgemeinen Übersicht, Familien A und B wurden beobachtet, dass drei aufeinanderfolgende oder mehr Generationen beteiligt waren. Das Verhältnis von Mann zu Frau wurde in 1:6 geschätzt. Das mittlere Alter bei Einschluss betrug 42 Jahre (SD 11,8), während das mittlere Alter des Auftretens der Läsionen 28 Jahre betrug (SD 11,8). Frauen berichteten von einer Spitzeninzidenz von Knötchen nach ihrer Schwangerschaft. Zu den klassischen klinischen Merkmalen der FML gehörten weiche Knötchen, die in Anzahl und Größe sehr unterschiedlich waren, sich im Unterhautfett befanden und auf den Rumpf und die Extremitäten beschränkt waren, wie in Abbildung 2 dargestellt. Komorbide gastrointestinale Störungen waren bei Patienten A, C und D2 vorhanden. Sie berichteten über Divertikulitis und Polypen, schwere chronische Verstopfung und Darmkrebs. Bei vier Patienten wurden subkutane Läsionen histologisch untersucht. Das Vorhandensein reifer Adipozyten, die von zahlreichen Kapillaren abgerundet wurden, bestätigte die Angiolipomdiagnostik, wie von Bancroft und Fletcher et al10,28 (Abbildung 2). Weitere relevante Befunde sind in Tabelle 1 beschrieben.

Abbildung 1 Übersicht über die Stammbäume der untersuchten Familien (A–E). Beachten Sie, wie Frauen und Männer gleichermaßen beteiligt sind und das autosomal dominante Vererbungsmuster mit fast zwei aufeinanderfolgenden Generationen betroffen ist. Familie A hatte die höchste Anzahl von Generationen, die multiple Lipome (a) entwickelten. Die Proband A (III 2) war die einzige innerhalb ihrer Familiengruppe und in der Kasuistik in Bezug auf Schmerzen, wenn untersucht wurde (a). Pfeile zeigen die Probanden an.

Abbildung 2 Klinische Merkmale der FML und histopathologische Aspekte von Lipomen (HE) (10×). Zu den primären Befunden gehören weiche, bewegliche und umschriebene schmerzlose Knötchen, die sich im Unterhautfett befinden. Die häufigste topographische Verteilung umfasst die oberen Extremitäten (A, B und D), die vordere Bauchwand, den Rücken und die Oberschenkel (C). Das Lipom weist normalerweise ein gelapptes Muster weißer Adipozyten mit gleichmäßigen Kernen und einer dünnen faserigen Kapsel (E) auf. Angiolipome bestehen aus reifem Fett in Verbindung mit zahlreichen kleinen Blutgefäßen, die überwiegend Kapillaren sind. Fibrinthromben (Pfeile) sind sehr häufig (F). Bilder mit freundlicher Genehmigung der Abteilung für Pathologie und medizinische Genetik, School of Medical Sciences, UNICAMP.

Molekulare

Die Sanger-Sequenzierung ergab zwei neuartige Varianten im Exon 5 des HMGA2-Gens. Beide Varianten wurden bei Patienten A und B1 identifiziert. Die erste war eine synonyme heterozygote Variante c.327C>T p.(Asp=) wird als wenig wirksam oder neutral angesehen, basierend auf mehreren Vorhersagewerkzeugen (VEP, FATHMM, UMD-predictor, SIFT, PROVEAN). Im Gegensatz dazu war die zweite Veränderung eine Nonsense-Änderung heterozygote Variante c.328T>C (p.*110Glnext*16), die eine Stop-Codon-Substitution durch Glutamin-Aminosäure und die anschließende Verlängerung des endgültigen Proteins verursacht (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). Abbildung 3 schematisiert die Struktur des HMGA2-Gens, die Proteinbindungsdomänen und die neuen Varianten.

Abbildung 3 Struktur des menschlichen HMGA2-Gens. (A) Auf 12q14.3 gelegen, erstreckt sich das HMGA2-Gen über mehr als 140 kb und umfasst fünf Exons. Exon 1, 2 und 3 (blaue Kästchen) kodieren für eine AT-Hook-Domäne (blaue Kreise). Das vierte Exon (lilac) kodiert für eine Spacer-Region. Exon 5 (rosa Kasten)kodiert die C-terminale Domäne des Proteins von 109 Aminosäuren. (B) Elektropherogramm von Patienten A, B1 und Referenz. Bei diesen Patienten wurden zwei identische neue Varianten gefunden. Eine synonyme heterozygote Variante c.327C>T (p.Asp=) und eine No-Stop-Änderung heterozygote Variante c.328T>C (p.*110Glnext*16).

Die Variante c.328T>C (p.*110Glnext*16) wurde gemäß den genannten in silico Algorithmen als 100% pathogen oder High impact definiert. Das Schnuppervorhersagesystem zeigte jedoch eine Diskrepanz zwischen den beiden beschriebenen Varianten, wie in Tabelle 3 dargestellt. Das gezielte Multi-Gen-Panel von AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA und PTEN in den Familien A, B, C, D und E konnte keine schädlichen Veränderungen der untersuchten Sequenzen nachweisen.

Tabelle 3 Varianten in Individuen A und B1 und Vergleich zwischen Vorhersagewerkzeugen

Diskussion

Die aktuelle Studie zielte darauf ab, die molekularen Grundlagen der FML durch die Integration moderner Sequenzierungstechniken wie Sanger-Sequenzierung und NGS in Kombination mit traditionellen klinischen Ansätzen zu identifizieren.

Nach früheren Studien zeigt die vorliegende Forschung einige Abweichungen in Bezug auf epidemiologische Daten. Wir haben festgestellt, dass es ein weit verbreitetes Missverständnis über die Klassifizierung und Diagnose verschiedener Arten von Lipomatose gibt.7,10,15 Mehrere Autoren betonen, dass Männer eine hohe Tendenz haben, multiple Lipome zu präsentieren,11,29,30 Unsere Ergebnisse zeigen jedoch eine offensichtlich hohe Häufigkeit von FML bei Frauen. Es ist möglich, dass dieser Befund lediglich eine Auswahlverzerrung aufgrund der geringen Stichprobengröße widerspiegelt, oder kann auch durch die Tatsache erklärt werden, dass Frauen aufgrund kosmetischer Bedenken häufiger medizinische Hilfe in Anspruch nehmen.31 Die Stammbäume weisen jedoch darauf hin, dass der Anteil der Betroffenen bei beiden Geschlechtern ähnlich war, was zu einem Geschlechterverhältnis von nahezu 1: 1 (10 Männer gegenüber 13 Frauen) führte, was die tatsächliche Prävalenz von FML unterschätzen könnte.6,8,16 Interessanterweise war die Gesamtzahl der bei Frauen festgestellten Lipome höher als bei den untersuchten Männern.1,14

Faktoren wie Übergewicht und verstärktes Knötchenwachstum während und nach Schwangerschaften deuten darauf hin, dass exogene Faktoren (Ernährung), metabolische Veränderungen (Dyslipidämie oder Veränderungen der Fettsäureentsättigung) und hormonelle Mechanismen an der Adipozytenhyperplasie beteiligt sein können.32,33 Yee et al verglichen Unterschiede in der enzymatischen Entsättigung von Stearoyl-CoA zwischen Personen mit seltenen adipösen Störungen (RAD) und adipösen Kontrollgruppen und kamen zu dem Schluss, dass Personen mit FML und Adipositas die höchsten Entsättigungsraten aufwiesen, wodurch der Lipogeneseprozess erhöht wurde.32,34

Ein unerwarteter Befund war, dass Patientin A die einzige innerhalb der kasuistischen und ihrer Familiengruppe war, die Schmerzen, tägliche Schwäche, Müdigkeit und psychiatrische Komorbidität (chronische Depression und Angststörung) zeigte. Diese Symptome sind stark mit der Dercum-Krankheit verbunden, die als Differentialdiagnose oder Variante der FML angesehen wird.35 Basierend auf der von Hansson et al. vorgeschlagenen neuen Klassifikation der Dercum-Krankheit 36 identifizierten wir bei diesem Patienten die generalisierte Knotenform, die durch starke Schmerzen auf der Oberfläche des Fettgewebes und um Lipome gekennzeichnet ist. Eine weitere Studie, die diese Hypothese stützt, wurde von Campen et al37 veröffentlicht Sie beschrieben eine Familie von neun Mitgliedern, bei denen multiple Lipome diagnostiziert wurden und deren variable Symptome von einer vollständigen Behinderung bis zu asymptomatischen Knötchen reichten. Es kann daher angenommen werden, dass die Segregation einem autosomal dominanten Muster mit variabler Expressivität folgt und möglicherweise eine extreme Manifestation der FML darstellt.

In Bezug auf die histopathologische Diagnose unterscheiden wir zwei Haupttypen: Lipom und Angiolipom. Mikroskopisch gesehen ist das häufigste auffällige Merkmal des Angiolipoms die Proliferation feiner Blutgefäße, die Fibrinmikrothromben in Verbindung mit reifen Adipozyten enthalten.10,28 Angiolipome scheinen eine hohe Inzidenz bei jungen erwachsenen Männern zu haben, die gelegentlich leichte Schmerzen oder Empfindlichkeit zeigen. Diese Art von Tumor hängt auch mit der Vorgeschichte eines lokalen Traumas oder der Anwendung einer Steroidtherapie zusammen.13,38 Obwohl viele Autoren beide Diagnosen als unterschiedliche pathologische Entitäten anerkennen, machen einige Fallberichte diese Unterscheidung aufgrund sehr subtiler Unterschiede zwischen ihnen nicht.39 In diesem Zusammenhang bestätigt unsere Analyse, dass es möglich ist, Angiolipome mit familiärem Rezidiv zu haben, und diese Diagnosen könnten Teil des breiten Spektrums der FML sein.40-43 Darüber hinaus wurde in mehreren Familien auch über multiple Spindelzell-Lipome, eine andere Art von Lipomen, berichtet.44

Obwohl es mehrere Studien gibt, die sich auf die Expression und direkte zytogenetische Analyse sporadischer Lipome konzentrieren, waren nur wenige Studien besorgt über konstitutionelle Ursachen von FML.2 Umfangreiche Lipomreihen bei Erwachsenen bestätigen multiple strukturelle Umlagerungen mit Frequenzen zwischen 50 und 75%.10,28,45 Unter diesen ausgeglichenen chromosomalen Veränderungen wird die Translokation t(3; 12)(q27-28; q13-15) bei fast 25% der Tumoren beobachtet.9 In den meisten Fällen beeinflusst Breakpoint das HMGA2-Gen, das aus 5 Exons besteht und ein Protein mit 109 Aminosäuren erzeugt (Abbildung 3).18,46,47 Ligon et al berichteten über den Fall eines achtjährigen Jungen mit einer konstitutionellen Umlagerung, die die Bande 12q14.3 (de novo perizentrische Inversion) betraf und somit das HMGA2-Gen betraf. Der klinische Phänotyp, der durch somatisches Überwachsen, Fortschreiten des Knochen- und Zahnalters, Kleinhirntumor und multiple Lipome gekennzeichnet ist,48 unterscheidet sich jedoch von unserem kasuistischen.

Wir analysierten die heterozygoten Varianten c.327C>T p.(Asp=) und c.328T>C (p.*110Glnext*16) von Exon 5 des HMGA2-Gens in verschiedenen Vorhersageprogrammen. Die synonyme oder stille Veränderung wurde als gutartig interpretiert, während die Änderung des Translationsstoppcodons als 100% pathogen oder hochwirksam angesehen wurde. Auf diese Weise könnte dies darauf hindeuten, dass Änderungen an der 3ʹ UTR-Region (nicht translatiert) die neoplastische Transformation des HMGA2-Gens auslösen würden.49 Fusco et al. hoben die entscheidende Rolle des HMGA2-Gens bei mesenchymalen Tumoren hervor. Sie schlugen vor, dass im HMGA2-Gen die 3ʹ UTR-Region im Allgemeinen durch Let-7-miRNA zum Schweigen gebracht wird und jede Veränderung auf dieser Ebene, entweder Trunkierung oder Fusion mit ektopischen Sequenzen, zu ihrer Hochregulierung und folglich zu einer abnormalen Replikation von Zellen führt.46

Es ist etwas überraschend, dass wir in Familie B beide neuartigen Varianten nur bei der Mutter (B1) entdeckt hatten. Dies könnte darauf hindeuten, dass sie sich nicht mit dem FML-Phänotyp trennen und zumindest in dieser Familie als ätiologische Ursache verworfen werden. Auf der anderen Seite präsentierte Patient A die gleichen zwei neuartigen Varianten, zeigte jedoch einen Phänotyp, der stark auf die Dercum-Krankheit hindeutet. Trotz dieser vielversprechenden Ergebnisse sind sie etwas schwierig zu interpretieren, da es nicht möglich war, andere von FML betroffene Angehörige zu beurteilen.

Fokale Fettinfiltration und multiple Lipome können in mehreren Syndromen vorhanden sein. Proteus-Syndrom und Nelken (angeborenes lipomatöses asymmetrisches Überwachsen, Gefäßfehlbildungen, epidermale Nävi, Skelett- und Wirbelsäulenanomalien) sind Beispiele für somatische Mutationen, bei denen Lipomatose vorliegt.50,51 Andererseits sind das Bannayan-Riley-Rubacalva-Syndrom, die Multiple endokrine Neoplasie Typ 1, das Cowden-Syndrom und das Gardner-Syndrom Zustände, die auf Keimbahnmutationen mit begleitender Lipomatose zurückzuführen sind.52-55 Sogar einige Mutationen mit mitochondrialer Funktion hängen mit abnormalem Fettgewebswachstum zusammen, hauptsächlich im oberen Rumpf und Hals, und das beste Beispiel ist die Madelung-Krankheit.56 Das negative Panel von AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA und PTEN schließt jedoch aus, dass sie zumindest in dieser Studie für den FML-Phänotyp verantwortlich sind.

Schlussfolgerung

FML ist eine seltene und heterogene Erkrankung, die sich mit anderen dermatologischen Syndromen wie Dercum-Krankheit überschneiden kann. Die Naturgeschichte der FML in dieser Serie zeigte, dass die Entwicklung von Läsionen progressiv war und ihre höchste Inzidenz bei Personen mittleren Alters erreichte. FML betraf beide Geschlechter und zeigte eine topographische Verteilung mit Vorherrschen in Extremitäten und Rumpf. Das Geschlechterverhältnis unter den untersuchten Patienten zeigte eine weibliche Prävalenz, aber die Stammbaumdaten zeigten eine ausgewogenere Verteilung. Die Diagnose Dercum-Krankheit wurde auch bei einer Person (Patient A) erkannt.

Der molekulare Ansatz hat einen tieferen Einblick in die genetischen Grundlagen der FML gegeben und versucht, die größte Anzahl von Kandidatengenen, die damit verbunden sind, gründlich zu untersuchen. Wir haben den Nutzen von NGS neben der Sanger-Methode für das Verständnis des gesamten FML-Spektrums hervorgehoben, da es eine Alternative für die ätiologische Identifizierung und Charakterisierung seltener genetischer Erkrankungen im klinischen Umfeld bieten könnte. Varianten im Exon 5 des HMGA2-Gens wurden nicht beschrieben und haben bisher eine ungewisse Bedeutung für die Genese von FML. Weitere Studien, einschließlich einer größeren Anzahl betroffener Personen und einer funktionellen Analyse der neuen Varianten des HGMA2-Gens, sollten durchgeführt werden, um seine biologische Funktion bei FML besser zu bestimmen.