EINFÜHRUNG

Halophile sind eine interessante Gruppe von Organismen, die bei hohem Salzgehalt gedeihen. Diese Organismen können aufgrund ihres optimalen Salzgehalts für das Wachstum in milde Halophile (1-6%, w / v NaCl), moderate Halophile (7-15%) und extreme Halophile (15-30%) eingeteilt werden (Madigan und Martinko, 2006). Umfangreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass Halophile nicht auf eine der Lebensdomänen beschränkt sind, sondern Eukaryoten sein können (Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar et al., 2005) oder Prokaryoten, die zu den Domänen von Bakterien und Archaeen gehören. Die Algengattung Dunaliella und die Artemia Artemia (Boetius und Joye, 2009) sind Beispiele für halophile Eukaryoten, während Halobacterium und Salinibacter Beispiele für halophile Prokaryoten sind. Der Erfolg von Halophilen beim Überleben in stark salzigen Umgebungen beruht auf einzigartigen physiologischen Anpassungen wie der Ionenpumpstrategie und der Akkumulation organischer gelöster Stoffe (Oren, 2006; Madigan und Martinko, 2006). Auf genomischer und proteomischer Ebene zeichnen sich Halophile durch einen hohen GC-Gehalt und Proteine durch eine geringe Hydrophobie, Überrepräsentation von sauren Resten, geringere Neigungen zur Helixbildung und höhere Neigungen zur Spulenstruktur aus (Paul et al., 2008).

Halophile erhalten jetzt mehr Zugang zur industriellen Mikrobiologie und Biotechnologie, da Halophile bei hoher Salzkonzentration wachsen und dadurch das Kontaminationsrisiko während der Kultivierung minimiert wird (Oren, 2006). Einige Beispiele für biotechnologische Anwendungen sind die Verwendung von Micrococcus varians zur Herstellung von Nuklease H (Kamekura el al., 1982) und die Verwendung der halophilen Tetragenococcus-Stämme bei der Herstellung von Sojasauce und der Herstellung einiger Enzyme einschließlich Hydrolasen (Amylasen, Nukleasen, Phosphatasen und Proteasen) (Oren, 2006). Halophile sind auch wichtig für den biologischen Abbau und die Bioremediation, da viele Halophile Kohlenwasserstoffe und andere toxische Verbindungen abbauen können (Ventosa et al., 1998). Halophile können aufgrund ihrer Tensidaktivität und bioemulgierenden Eigenschaften auch Polymere herstellen, die als Verstärker der Ölrückgewinnung verwendet werden (Oren, 2006).

Halophile gedeihen in Umgebungen mit hohem Salzgehalt wie Ozeanen, Sonnensalzen und natürlichen Salzseen (Oren, 2007). Das Tote Meer von Jordanien ist einer der größten hypersalinen Binnensalzseen der Welt (Boetius und Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan und Martinko, 2006). Neben hohem Salzgehalt; salz, Konzentration von über 340 g L-1 (Oren, 2007), das Tote Meer ist einzigartig durch seinen hohen Luftdruck (800 mmHg) aufgrund der sehr geringen Höhe unter dem Meeresspiegel, Sauerstoffpartialdruck (PIO2) von 8% mehr als auf Meereshöhe, einzigartige UV-Strahlung, niedrige Luftfeuchtigkeit (unter 40%) und Regenmangel (Avriel et al., 2011).

Diese Studie wurde durchgeführt, um die halophilen heterotrophen Bakterienarten zu klassifizieren, die in der Küstenzone des Toten Meeres von Jordanien gedeihen. Die mikrobielle Klassifikation basiert auf Kolonial- und Zellmorphologie sowie Ähnlichkeit im 16S-rRNA-Gen.

MATERIALIEN UND METHODEN

Probenahme: Wasserproben aus dem Toten Meer wurden aus vier Küstenzonen entnommen (Abb. 1) im März, Juni und Oktober 2011. Die geografischen Koordinaten und die Höhe der Probenahmestellen sind in Tabelle 1 angegeben. Geographische Koordinaten und Höhe wurden für jeden Standort von (eTrex Legend C, Taiwan) bestimmt. Wasserproben aus dem Toten Meer wurden in einer sauberen sterilen 1-Liter-Glasflasche mit ausreichend Kopfraum in der Flasche entnommen und sofort ins Labor transportiert.

Physikalisch-chemische Analyse der Proben: Temperatur, pH-Wert, Total Dissolved Solids (TDS) und biologischer Sauerstoffbedarf (BSB) von Wasserproben wurden bestimmt. Wassertemperatur, pH-Wert und Salzgehalt wurden in situ gemessen. Wassertemperatur und pH-Wert wurden mit einem tragbaren pH-Meter (Mikrocomputer pH Meter T19000, Trans Instruments) gemessen. Der Salzgehalt wurde mit einem tragbaren Salzgehalt-Refraktometer gemessen. Der BSB wurde im (Water, Environment and Arid Regions Research Center at Al al-Bayt University, Jordanien) gemessen. Wasserproben wurden in eine neue Glasflasche überführt, dann wurden 1 ml Phosphatpuffer, Magnesiumsulfat, Calciumchlorid, Eisenchloridlösungen pro Liter Wasserprobe zugegeben. Die Probe wurde dann auf eine Temperatur von 20±3°C gebracht und mit organisch freier filtrierter Luft gesättigt. Der pH-Wert der Probe wurde überprüft. Wenn die Probe nicht im Bereich von 6,5-7,5 lag, wurde Schwefelsäure oder Natriumhydroxid zugegeben, um die Probe auf den erforderlichen pH-Bereich (6,5-7,5) zu bringen, und die hinzugefügte Konzentration verdünnte die Probe nicht mehr als 0,5%. Die Probe wurde vor Verdünnungen auf eine Temperatur von 20 ° C gebracht. Ein geeignetes Volumen der Probe wurde dann in BSB-Flaschen überführt. Die Flasche wurde mit genügend Verdünnungswasser gefüllt, um die gesamte Luft zu verdrängen und keine Blasen zu hinterlassen. Gelöster Sauerstoff (DO) wurde unter Verwendung eines DO-Analysators bestimmt und alle verdrängten Inhalte wurden durch Verdünnungswasser ersetzt und der Stopfen fest verschlossen. Die Flasche wurde 5 Tage bei 20°C inkubiert. Danach wurde DO bestimmt und BSB nach der Differenz zwischen initialem und endgültigem DO über Volumen berechnet.

Anreicherung, Isolierung und Gram-Färbung: Zur Anreicherung von Wasserproben wurde Totes Meerwasser (10 ml) in 90 ml flüssiges Medium mit hohem Salzgehalt überführt und bei 30 °C im Dunkeln unter Schütteln (100 U / min) inkubiert. Nach ca.12 h wurde eine Schleife Anreicherungskultur auf modifiziertem festem Mineralsalzmedium gestreift und die abgetrennten Kolonien anschließend subkultiviert. Glycerinvorräte der Isolate wurden ebenfalls hergestellt und zur weiteren Analyse bei -20°C gelagert. Die Zellen wurden Gram-gefärbt und unter dem Mikroskop untersucht.

16S rRNA-Gensequenzierung und -analyse: Die Amplifikation und Sequenzierung der 16S rRNA-Gensequenz wurde von Macrogen Inc. durchgeführt., Seoul, Korea, nach folgendem Verfahren hergestellt: Junge Kolonien der Bakterienstämme wurden in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 0,5 ml steriler Kochsalzlösung suspendiert und anschließend 10 min bei 10.000 upm zentrifugiert. der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 0,5 ml InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA) suspendiert und 30 min bei 56°C inkubiert und anschließend 10 min auf 100°C erhitzt. Nach dem Erhitzen wurde der Überstand zur PCR verwendet. Die PCR erfolgte durch Mischen von 1 µL Template-DNA mit 20 µL PCR-Reaktionslösung. 27F/1492R Zündkapseln (27F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: 5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) wurden zur Amplifikation verwendet und anschließend 35 Amplifikationszyklen bei 94°C für 45 sec, 55°C für 60 sec und 72°C für 60 sec durchgeführt. Die gereinigten PCR-Produkte von ca.1.400 bp wurden durch 518F/800R-Primer sequenziert (518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Die Sequenzierung wurde unter Verwendung des Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied BioSystems, USA) durchgeführt. Sequenzierungsprodukte wurden auf einem automatisierten DNA-Sequenziersystem von Applied Biosystems Modell 3730XL (Applied BioSystems, USA) bei the Macrogen, Inc., Seoul, Korea.

Die Sequenzen wurden analysiert und mit der öffentlichen Nukleotiddatenbank unter Verwendung der NCBI BLAST-Website verglichen (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Sequenzen der nächsten Verwandten wurden dann aus der Datenbank abgerufen und verwendet, um einen phylogenetischen Baum mit MEGA5 zu konstruieren (Tamura et al., 2011). GC-Gehalt Die Sequenzen wurden mit dem Oligo-Rechner berechnet (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

ERGEBNISSE

Physikochemische Eigenschaften der Proben: Wasserproben aus dem Toten Meer waren sehr salzhaltig (36-38%). Die pH-Werte der Proben waren niedrig und liegen zwischen 5,6 und 6,3. Dies weist auf die leicht saure Eigenschaft von Meerwasser hin. Der BSB-Wert war sehr niedrig (1-2 mg O2 L-1), was auf einen sehr geringen Gehalt an organischem Material in der Probe hinweist. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften sind in Tabelle 2 dargestellt.Heterotrophe lebensfähige Bakterienzahl: Die Ergebnisse der lebensfähigen Keimzahl zeigten eine sehr geringe Anzahl von koloniebildenden Einheiten in jeder Probe (200-6000 KBE mL-1). Die KBE-Zahl ist in Tabelle 3 näher dargestellt.Isolierung und Klassifizierung von halophilen heterotrophen Bakterien: In dieser Studie haben wir 44 halophile heterotrophe Bakterienstämme isoliert. Elf von 44 Bakterienstämmen wurden aufgrund ihrer kolonialen Morphologie, Gramfärbung und Zellmorphologie als unterschiedlich angesehen. Sieben von elf verschiedenen Stämmen waren grampositiv und 4 von 7 waren gramnegativ. Die Bakterienstämme wurden basierend auf einer 16S-rRNA-Genanalyse identifiziert und es wurde festgestellt, dass sie zur Domäne der Bakterien gehören. Der nächste Verwandte jedes isolierten Bakterienstamms ist in Tabelle 4 und Abb. 2. Alle Sequenzen zeigten einen relativ hohen GC-Gehalt (bis zu 58%).

DISKUSSION

Die physikochemischen Eigenschaften von Wasserproben aus dem Toten Meer wurden bestimmt und analysiert. Der Salzgehalt wurde als sehr hoch befunden (bis zu 38%). Dies ist ein typisches Merkmal des Wassers aus dem Toten Meer und macht es zu einer der berühmten “athalassohalinen” Solen (Oren, 2007). Es wurde festgestellt, dass der pH-Wert von Wasser aus dem Toten Meer leicht sauer ist (5,6-6,3), verglichen mit dem pH-Wert (7,5-8) in thalassohalinen Solen (Oren, 2007). Der BSB der Proben war sehr niedrig (1-2 mg O2 L-1) und reflektierte wenig organisches Material in Wasser, das von heterotrophen Bakterien genutzt werden konnte. Diese physikalisch-chemischen Bedingungen wirken sich zweifellos negativ auf die mikrobielle Vielfalt aus. Daher war die Anzahl der lebensfähigen Zellen in den getesteten Proben im Vergleich zu offenem Meerwasser sehr gering (nicht mehr als 6×102 KBE mL-1). Die Anzahl heterotropher Bakterien in Meeresgewässern liegt normalerweise in der Größenordnung von 105 bis 106 Bakterien mL-1 (Zweifel und Hagstrom, 1995; Madigan und Martinko, 2006). Diese Zahlen stammen aus unspezifischen Fluoreszenzfärbetechniken (Zweifel und Hagstrom, 1995), die normalerweise höhere Zahlen ergeben als die Plate Count-Methode. Die ersten Veröffentlichungen zur Bakterienzahl im Toten Meer wurden mikroskopisch durchgeführt. Die Zellennummer war ungefähr 1.9×106 Zellen mL1 und während einer Blüte roter Halobakterien erreichten die Populationsdichten 1,9×107, gingen aber nach Motten auf 5×106 zurück (Oren, 1983).Die Forschung an halophilen Organismen, die im Toten Meer leben, begann sehr früh im Jahr 1892, als Bakterien aus der Gattung Clostridium aus Schlamm isoliert wurden (Oren, 2002). Später, in einem kurzen Artikel im Jahr 1936 veröffentlicht, gab die erste Beschreibung einer einheimischen mikrobiellen Gemeinschaft an die extrem harten Bedingungen des Toten Meeres angepasst (Oren und Ventosa, 1999). Seit dieser Zeit erweitert und akkumuliert sich unser Wissen über die biologischen Aspekte des Toten Meeres. Wir haben diese Forschung durchgeführt, um unser Wissen über die halophilen heterotrophen Bakterien zu erweitern, die in der Küstenzone des jordanischen Toten Meeres gedeihen. Wir haben verschiedene Bakterienarten isoliert. Anschließend isolierten und identifizierten wir 11 verschiedene Arten von halophilen Bakterien. Die meisten Isolate waren grampositiv (7 von 11). Obwohl grampositive Bakterien wichtige Anpassungen besitzen, können sie mit Umweltstress wie hohem Salzgehalt umgehen (Battistuzzi und Hedges, 2009). In der Literatur ist nicht klar, ob grampositive Bakterien oder gramnegative Bakterien in hypersalinenumgebungen dominieren. In einer Studie über prokaryotische Halophile, die aus Sedimenten des flachen Salzsees El-Djerid in Tunesien gewonnen wurden, Hedi et al. (2009) fanden heraus, dass die dominante Bakterienpopulation zu grampositiven sporenbildenden Bakterien gehört.

Alle isolierten Stämme in dieser Studie gehören zur Domäne der Bakterien. Sie gehören zu 7 verschiedenen Gattungen in der Domäne. Fünf von sieben grampositiven Bakterienisolaten gehören zur Gattung Bacillus. Diese Gattung wurde 1872 gegründet, um drei Arten zu umfassen, aber jetzt gibt es 142 benannte Bacillus-Arten, die in Bergeys Handbuch der systematischen Bakteriologie (Logan und de Vos, 2009) aufgeführt sind. Bacillus-Stämme sind typischerweise Bodenstämme. In dieser Studie isolierte Bacillus-Stämme gehören zu den folgenden Arten B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis und B. cereus. Diese Stämme wurden in verschiedenen salzigen Umgebungen angetroffen (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Yoon et al., 2004; Al-ZaZaee et al., 2011). Zum Beispiel, B. licheniformis wurde zuvor von Miranda et al. (2008), während B. pumilus zusätzlich zu Sedimenten von Parvathi et al. aus Meeresorganismen wie Austern, Krabben und Fischen isoliert wurde. (2009). B. hwajinpoensis wurde aus Meerwasser des Ostmeeres und des Gelben Meeres in Korea gewonnen (Yoon et al., 2004). Und schließlich wurde B. cereus, ein häufiges Bodenbakterium, im Abwasser angetroffen, jedoch mit halophilen Eigenschaften (Al-ZaZaee et al., 2011). Dicke Zellwand, hoher Peptidoglycangehalt (mehr als 90% der Zellwand) (Madigan und Martinko, 2006), hoher GC-Gehalt und resistente Sporenbildung sind die Hauptgründe für das Überleben von Bazillus unter rauen Bedingungen wie hohem Salzgehalt. Es sollte beachtet werden, dass der Stamm DSD32 (identifiziert als B. cereus) die sehr geringe Ähnlichkeit mit seinem nächsten Verwandten B. cereus aufweist. Dieser Stamm kann eine neue Art in der Gattung Bacillus darstellen, die auf dem 16S-rRNA-Gen basiert.

Die beiden anderen grampositiven Bakterien sind Stämme von Arthrobacter sp. und Kocuria rosea. Arthrobacter-Arten sind in der Natur vor allem im Boden weit verbreitet (Funke et al., 1996), ist aber in hypersalinen Umgebungen nicht sehr häufig. Kocuria rosea gilt als mäßig halophile Art und wurde aus verschiedenen salzhaltigen Umgebungen wie salzhaltigem offenem Flachwasser gewonnen, und einige Stämme von Kocuria rosea wachsen optimal bei einer NaCl-Konzentration von 30% (Wright und Tanaka, 2002).

Gramnegative Bakterien waren in unseren Proben seltener (4 von 11). Dennoch zeigt die veröffentlichte Literatur, dass diese Isolate in salzigen Umgebungen nicht ungewöhnlich sind. Einer der isolierten Stämme wurde als Vibrio alginolyticus identifiziert. Die letztere Art ist tatsächlich in marinen Proben verbreitet (Molitoris et al., 1985) und wurde in Meeresmeerwasser angetroffen. Der Stamm hat medizinische Bedeutung, da er komplizierte Haut- und Weichteilinfektionen verursachen kann (Sganga et al., 2009). Noch wichtiger ist, dass einige Stämme von Vibrio alginolyticus Tetrodotoxin produzieren, ein starkes Neurotoxin (Noguchi et al., 1987). Ein weiteres gramnegatives Bakterium, das in dieser Studie identifiziert wurde, ist Chromohalobacter salexigens. Diese Art wurde zuerst isoliert und als mäßig halophile Art Halomonas elongata beschrieben und dann als neue Art von Chromohalobacter vorgeschlagen (Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli ist eine weitere in dieser Studie identifizierte Spezies. Diese Sorte ist auch nicht ungewöhnlich für salzhaltige Lebensräume. Es wurde kürzlich aus dem Watt des Gelben Meeres in Korea isoliert und von Yoon et al. (2005). Der letzte Stamm gehört zu Salinivibrio costicola. Diese Art wurde zuerst als Vibrio costicola beschrieben, aber ihre phänotypischen und genotypischen Eigenschaften unterschieden sie von Arten der Gattung Vibrio. Daher wurde der Stamm in eine neue separate Gattung namens Salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola ist mäßig halophil und wurde ursprünglich aus gesalzenen Lebensmitteln isoliert und wächst optimal in Medien mit 10% Salzen (Mellado et al., 1996). Ein Mitglied der Gattung Salinibacter, S. ruber, ist ein interessantes Modell für die Untersuchung der Anpassung von Mikroorganismen an das Leben bei hohen Salzkonzentrationen (Oren, 2007).

FAZIT

Das Wasser des Toten Meeres aus der Küstenzone zeichnet sich durch einen hohen Salzgehalt, einen niedrigen pH-Wert, einen niedrigen Gehalt an organischem Material (niedriger BSB) und viele verschiedene Arten heterotropher Bakterien aus, die sowohl grampositiven als auch gramnegativen Gattungen angehören, darunter Arthrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus und Erythrobacter.

DANKSAGUNG

Diese Studie wurde vom Dekanat für akademische Forschung der Al al-Bayt Universität, Jordanien, unterstützt, Beschluss des Wissenschaftlichen Forschungsrates in der Sitzung 2/2010/2011. Daher möchte der Autor die finanzielle Unterstützung der Universität zu schätzen wissen.