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A. Einführung

Das typische Verbundlichtmikroskop (Abb.1) ist in der Lage, unsere Fähigkeit, Details zu sehen, um das 1000-fache zu erhöhen, so dass Objekte mit einer Größe von nur 0,1 Mikrometer (um) oder 100 Nanometer (nm) gesehen werden können. Elektronenmikroskope erweitern diesen Bereich weiter, so dass wir Objekte mit einem Durchmesser von nur 0,5 nm oder etwa 1/200.000 der Größe, die wir mit bloßem Auge sehen können, sehen können. Unnötig zu erwähnen, dass die Entwicklung und Verwendung von Mikroskopen unser Verständnis von Zellen und ihrer Struktur und Funktion erheblich verbessert hat.

Abbildung 1. Binokulares Verbundmikroskop.

B. Vergrößerung, Auflösung und Arbeitsabstand

Die Vergrößerung ist einfach eine Funktion, um ein Objekt größer erscheinen zu lassen, z. B. wenn wir ein gedrucktes Wort mit einer Handlinse vergrößern. Das bloße Vergrößern eines Objekts ohne gleichzeitige Vergrößerung der Detailgenauigkeit liefert dem Betrachter kein gutes Bild. Die Fähigkeit eines Mikroskops (oder Auges), Details zu sehen, ist eine Funktion seines Auflösungsvermögens. Das Auflösungsvermögen ist definiert als der Mindestabstand zwischen zwei Objekten, bei dem die Objekte nur getrennt voneinander unterschieden werden können, und ist eine Funktion der verwendeten Lichtwellenlänge und der Qualität der Optik. Im Allgemeinen ist die Auflösung des Mikroskops umso höher, je kürzer die Wellenlänge der Lichtquelle ist.

Arbeitsabstand ist der Abstand zwischen der Objektivlinse und der Probe. Bei geringer Vergrößerung ist der Arbeitsabstand relativ groß. Wenn Sie die Vergrößerung erhöhen, nimmt der Arbeitsabstand dramatisch ab. Ölimmersionslinsen berühren die Probe taktisch. Beachten Sie diese Änderung des Arbeitsabstandes mit zunehmender Vergrößerung, um Schäden an Ihren Proben zu vermeiden.

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C. Teile des monokularen zusammengesetzten Lichtmikroskops:

Bitte nehmen Sie sich Zeit, um sich mit Ihrem Mikroskop und seiner ordnungsgemäßen Verwendung vertraut zu machen. Die Bedienelemente der beiden Mikroskope, die wir in unseren Kursen verwenden, sind unten dargestellt (Abb. 2).

Abbildung 2. Bedienelemente an den binokularen Verbundmikroskopen Leica und Olympus.

1. Augenlinse oder okular: unsere sind 10x vergrößerung. Die Bereiche, die wir verwenden werden, sind monokular (nur ein Okular.)

2. Körperrohr: Enthält Spiegel und Prismen, die das Bild auf die Augenlinse richten.

3. Objektivrevolver: hält die objektive, dreht, beachten sie die positive stoppt für jedes objektiv.

4. Objektive: in der regel 3-4 auf unsere scopes, 4x, 10x, 43x, 100x öl immersion (rot banding). Gesamtvergrößerung = Augenleistung x Objektivleistung.

5. Bühne: Plattform, auf der Dias zum Betrachten montiert sind; Einige Bereiche haben mechanische Stufen. Erfahren Sie, wie Sie die Folie richtig in Position bringen.

6. Blende: Die Blende steuert die Lichtmenge, die auf die Probe fällt, und kann den Fokus des Bildes drastisch beeinflussen. LERNEN SIE, DAS ZWERCHFELL SO SCHNELL WIE MÖGLICH ZU BENUTZEN. DIE MEISTEN PROBLEME, DIE SIE BEIM FOKUSSIEREN HABEN, SIND AUF EINE FALSCHE EINSTELLUNG DES LICHTS ZURÜCKZUFÜHREN.

Wir haben zwei Arten:

• Irisblende: Suchen Sie nach einem Hebel direkt unter der Bühne in der Nähe der Vorderseite.
• Zifferblatt-Typ: Direkt unter der Bühne befindet sich ein rotierendes Zifferblatt mit unterschiedlich großen Öffnungen (Löchern); Dieser Typ ist nützlich, um einen Pseudo-Dunkelfeldeffekt zu erzeugen.

7. Fokussierung knöpfe: Befindet sich auf seite von mikroskop; äußerste ist die feine fokus und innerste ist die grob fokus.
8. Lichtquelle: unsere scopes haben gebaut in lichtquellen. Der Drucktastenschalter befindet sich (meistens) hinter der Lichtlinse an der Basis.

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D. Pflege und Handhabung des Verbundmikroskops

Bei der Pflege der von Ihnen verwendeten Mikroskope sind nur wenige ABSOLUTE Regeln zu beachten. Gepflegt werden diese Instrumente viele Jahrzehnte halten und weiterhin gut funktionieren. Bitte melden Sie Störungen sofort Ihrem Instruktor.

1. Verwenden Sie IMMER zwei Hände, um das Zielfernrohr zu tragen – eine am Arm und eine unter der Basis – KEINE AUSNAHMEN! Tragen Sie das Zielfernrohr NIEMALS verkehrt herum, da das Okular herausfallen kann und wird.

2. Verwenden Sie Linsenpapier, um alle Linsen vor jeder Laborsitzung und nach der Verwendung der Ölimmersionslinse zu reinigen. VERWENDEN SIE NIEMALS, NICHT JETZT, NIE ETWAS ANDERES ALS LINSENPAPIER, UM DIE LINSEN ZU REINIGEN. Andere Papiere sind zu unrein und zerkratzen die optische Beschichtung der Linsen. Verwenden Sie beim Reinigen der Linsen auch keine Flüssigkeiten – NUR LINSENPAPIER!

3. Verwenden Sie immer die richtige Fokussiertechnik, um ein Rammen der Objektivlinse in ein Dia zu vermeiden – dies kann die Objektivlinse beschädigen und / oder ein teures Dia ruinieren.

4. Schalten Sie das Licht immer aus, wenn Sie das Zielfernrohr nicht verwenden.

5. Legen Sie den Draht immer vorsichtig aus dem Weg. Drähte, die in den Beinräumen geschleift sind, laden zu einer großen Mikroskopkatastrophe ein. Versuchen schiebe die draht unten durch die schublade griffe bside ihre bank raum.

6. Ersetzen Sie immer die Abdeckung des Mikroskops, wenn Sie es weglegen

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E. Fokussierungsverfahren: Monokulare Verbundmikroskope

1. Schalten Sie die Lichtquelle ein.

2. Wechseln Sie zum 10x Objektiv.

3. Ziehen Sie sich auf den groben Fokus zurück, um das Nasenstück anzuheben.

4. Stellen Sie den Objektträger auf den Tisch und sichern Sie ihn in der richtigen Position. Schauen Sie sich den Objektträger an und platzieren Sie ihn so, dass sich die Probe über der Lichtöffnung in der Bühne befindet.

5. Untere Objektivlinse bis zur unteren Grenze (in der Nähe des Objektträgers). Heben Sie das Objektiv mit dem Grobfokus-Regler an, bis das Bild scharf wird, und gehen Sie dann wieder aus. Passen Sie den Feinfokus ähnlich an.

6. Zentrieren Sie das Bild und passen Sie das Licht mit der Blende an.

7. Zentrieren Sie den Fokus neu und passen Sie ihn an, zuerst grob, dann fein wie in Schritt 5.

8. Membran nach Bedarf nachjustieren.

9. Schalten Sie nun die Objektive auf das 43-fache um, wenn eine höhere Vergrößerung erforderlich ist. Feinfokus und Licht (Blende) nach Bedarf nachjustieren.

Unsere Zielfernrohre sind parfokal, was bedeutet, dass, wenn Sie von niedriger (100x) zu hoher (430x) Leistung wechseln, ein fokussiertes Bild bei niedriger Leistung bei der höheren Leistung mehr oder weniger scharf bleibt. Höchstwahrscheinlich müssen Sie den feinen Fokus und die Blende leicht nachjustieren.

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F. Ölimmersionsverfahren

Bei einigen unserer monokularen und allen binokularen Verbundmikroskopen haben wir 100-fache Ölimmersionslinsen. Diese sind an einem roten Band um das Linsengehäuse erkennbar. Bei Vergrößerungen größer als etwa 500x wird das Licht zu stark gebrochen, wenn es durch Luft strömt, um ein gutes Auflösungsvermögen zu erzielen. Daher werden Optiken für diese höheren Vergrößerungen mit einem hochwertigen Mineralöl als Medium zur Übertragung von Licht verwendet. Es ist zwingend erforderlich, dass Sie nur Immersionsöl verwenden und die Linse nach jedem Gebrauch gründlich mit Linsenpapier reinigen.

1. Suchen Sie den gewünschten Bereich auf Ihrer Folie und zentrieren Sie ihn auf 430x.

2. Heben Sie die Objektivlinse an ihre Grenze (d.h., maximieren die abstand zwischen bühne und ziele) und schaukel die objektiv aus dem weg über auf halbem weg, um die nächste position.

3. Geben Sie vorsichtig einen kleinen Tropfen Immersionsöl direkt auf den Objektträger über die Mitte des interessierenden Bereichs.

4. Drehen Sie das Ölimmersionsobjektiv in Position und senken Sie es vorsichtig, während Sie von der Seite schauen, mit dem Grobfokusknopf ab, bis das Objektiv gerade Kontakt mit dem Öltropfen hat. Sie sehen, dass das Dropdown-Menü in eine Spalte springt, wenn der Kontakt hergestellt wird.

5. Senken Sie die Linse ein bisschen mehr ab und fokussieren Sie dann mit dem Feinfokus und dem Blick durch die Augenlinse auf die Probe.

6. Wenn Sie fertig sind, reinigen Sie die Linse mit Linsenpapier, bis kein Öl mehr austritt, und reinigen Sie die Folie, wenn sie gespeichert werden soll.

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G. Bestimmung des Sichtfelddurchmessers

Möglicherweise möchten Sie die Größe der Proben (z. B. Zellen) schätzen, die Sie im Labor sehen werden. Der beste Weg, dies zu tun, ist mit einem Augenmikrometer, einem Präzisions-Augenlinseneinsatz, bei dem ein Lineal in Glas geätzt ist. Die monokularen Zielfernrohre, die wir in den Einführungskursen verwenden, sind nicht so ausgestattet, daher verwenden wir eine alternative Methode, die auf der Kenntnis des Sichtfelddurchmessers für Ihr spezielles Mikroskop basiert. Dazu müssen Sie Folgendes bestimmen:

• der ungefähre Durchmesser Ihres Sichtfelds mit geringer Vergrößerung für Ihr spezielles Mikroskop.
• die Gesamtvergrößerung für jedes Ihrer anderen Objektive.

Wenn Sie dies für jede Objektivlinse wissen, können Sie die Größe der Probe mit dem bekannten Felddurchmesser vergleichen und ein angemessenes Größenklima erstellen. Diese Technik funktioniert für jedes Mikroskop.

1. Besorgen Sie sich eine Objektträgerskala und positionieren Sie sie auf Ihrem Zielfernrohr. Ein transparentes Lineal funktioniert ebenfalls.

2. Bringen es in fokus mit die 10x ziel (100x insgesamt). Die Skalenstäbe sind Inkremente von 1 mm, wie in der folgenden Abbildung gezeigt. Somit ist ein schwarzer Balken = 0,5 mm wie ein Leerzeichen.

3. Bewegen Sie die Folie so, dass der Rand eines äußeren schwarzen Balkens gerade tangential zum beleuchteten Feld ist (siehe Punkt „A“ oben).

4. Schätzen Sie ab diesem Rand, wie viele Balken und Leerzeichen erforderlich sind, um das Sichtfeld zu durchqueren. Sie müssen wahrscheinlich den letzten Bruchteil eines Leerzeichens oder Balkens schätzen. Für die meisten unserer Mikroskope ist es etwa 1,8 – 2,0 mm breit. Sie müssen dies an jedem Mikroskop überprüfen, das Sie verwenden, das kein okulares Mikrometer hat.

5. Notieren Sie die ID-Nummer und den Felddurchmesser Ihres Zielfernrohrs bei 100x in Ihrem Labornotizbuch als zukünftige Referenz.

6. Als nächstes berechnen Sie die Feldbreite bei 430x Gesamtvergrößerung mit der folgenden Formel (wir beziehen uns auf die 100x mag als „Low Power“ und 430x als „High Power“):

(low power mag/high power mag) x low power feld durchmesser (in mm)

Angenommen, sie bestimmen, dass die 100x feld durchmesser ist 1,8mm, bei 430x, die feld durchmesser wäre:

(100 / 430) x 1,8 mm = 0,418 mm = 418 um (Mikrometer)

Beachten Sie, dass der Felddurchmesser bei hoher Leistung proportional zum Verhältnis der Objektive mit niedriger zu hoher Leistung ist. Das heißt, wenn Sie die Vergrößerung erhöhen, wird das tatsächliche Sichtfeld proportional kleiner.

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H. Binokulare Verbundlichtmikroskope
Teile des Lichtmikroskops

1. Augenlinse oder okular: unsere sind 10x vergrößerung. Die Zielfernrohre, die wir verwenden werden, sind binokular (zwei Okulare).

2. Körperrohr: Enthält Spiegel und Prismen, die das Bild auf die Augenlinsen richten.

3. Objektivrevolver: hält die objektive, dreht

4. Objektive: in der regel 3-4 auf unsere scopes, 4x, 10x, 43x, 100x öl immersion (rot banding). Gesamtvergrößerung = Augenleistung x Objektivleistung. Die meisten unserer Ferngläser haben Objektive mit fester Position – die Bühne bewegt sich eher auf und ab als die Linse.

5. Stadium: Bewegliche Plattform, auf der Dias für die Betrachtung angebracht werden; alle unsere Bereiche haben mechanische Stadien mit X, Y-Nonius-Skalen. Fokusknöpfe bewegen die Bühne auf und ab.

6. Kondensator: Eine Unterstufenlinse, die das Licht auf die Probe fokussiert. Unsere Ferngläser haben Kondensatoren, die sich auf und ab bewegen, um den Lichtstrahl zu fokussieren.

7. Irisblende: die Blende befindet sich direkt unter dem Tisch und steuert die Lichtmenge, die auf die Probe fällt und den Fokus des Bildes drastisch beeinflussen kann.

8. Fokussierung knöpfe: äußerste ist die feine fokus und innerste ist die grob fokus. Bei den Binoccs steuern diese Regler die Auf- / Abbewegung der Bühne.

9. Lichtquelle: unsere scopes haben gebaut in lichtquellen. Der Rheostat-EIN / AUS-Schalter befindet sich entweder am Zielfernrohr oder an der externen Stromversorgung und dient zur Regulierung der Lichtintensität.

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I. Fokussierungsverfahren: Binokulare Verbundmikroskope

1. Schalten Sie die Lichtquelle ein. Binoc Scopes haben entweder eine eingebaute Einheit oder eine externe Stromversorgung.

2. Wechseln Sie zum 10x Objektiv.

3. Passen Sie den Grobfokus an, um das Nasenstück anzuheben (oder die Bühne abzusenken).

4. Befestigen Sie den Objektträger in der richtigen Position auf dem Tisch.

5. Schauen Sie sich die Augenlinsen Ihres Zielfernrohrs an. Ein Objektiv ist fest und das andere hat einen Fokussierring (wie ein Fernglas). Bringen Sie die Linse so nah wie möglich an den Objektträger heran und schauen Sie dann nur noch durch die feste Augenlinse, bis die Probe gerade scharf wird. Stellen Sie den Feinfokus für das feste Objektiv ähnlich ein.

6. Wenn Sie nun nur durch das verstellbare Okular schauen, stellen Sie den Fokus mit dem Fokusring um das Objektiv ein. Schauen Sie mit beiden Augen (passen Sie den Augenabstand an, um ein einzelnes rundes beleuchtetes Feld zu sehen) und nehmen Sie kleinere Anpassungen vor, um den Fokus zu fokussieren.

7. Zentrieren Sie das Bild und passen Sie das Licht mit der Kondensorlinse, der Irisblende und dem Rheostat der Lichtquelle an.

8. Zentrieren Sie den Fokus neu und passen Sie ihn an, zuerst grob, dann fein wie in 5.

9. Membran nach Bedarf nachjustieren.

10.Schalten Sie nun Ziele auf eine höhere Leistung. Feinfokus und Licht (Blende) nach Bedarf nachjustieren.

Unsere Zielfernrohre sind parfokal, was bedeutet, dass ein fokussiertes Bild bei niedriger Leistung bei höherer Leistung mehr oder weniger scharf bleibt, wenn Sie von niedriger zu hoher Leistung wechseln. Höchstwahrscheinlich müssen Sie den Feinfokus und die Blende leicht nachjustieren (erhöhen Sie das Licht bei höheren Leistungen.

Modified 11-6-15 gja

Department of Biology, Bates College, Lewiston, ME 04240