Identifizierung von HPO4 2− Ionen im Knochenmineral

Der direkte Festkörper-Kernspinresonanz-Nachweis (ssNMR) der im Knochenmineral lokalisierten Protonen aus einer intakten Knochengewebeprobe ist nicht möglich. Dies ist auf das Vorhandensein der extrazellulären organischen Matrix zurückzuführen, deren unterschiedliche Signale das 1H Single Pulse (SP) ssNMR-Spektrum einer Knochengewebeprobe dominieren54. Die Möglichkeit, räumliche Proximitäten zwischen Wasserstoff- und Phosphorkernen im zweidimensionalen (2D) {1H} 31P Heteronuclear Correlation (HetCor) ssNMR-Experiment im atomaren Maßstab aufzudecken, ermöglicht jedoch die Untersuchung von Knochenmineralwasserstoffumgebungen durch die Analyse der F1-Dimension (Abb. 1A). Leider ist dieses Experiment zeitaufwendig und führt zu einer 1H-Projektion der vertikalen (F1) Dimension mit einem relativ schlechten Signal-Rausch-Verhältnis (S / N) und einer niedrigen digitalen Auflösung (Abb. 1B). Um diese Einschränkungen zu überwinden, verwendeten wir das eindimensionale (1D) {1H-31P} 1H Double Cross Polarisation (CP) ssNMR Experiment. Es besteht aus einem doppelten CP-Transfer, der „hin und zurück“ durchgeführt wird (1H → 31P → 1H) (Abb. S1). Dieses Experiment ermöglichte es uns zunächst, 31P-gefilterte 1H ssNMR-Spektren von Knochenmineral aus einer intakten, kortikalen 2-jährigen Schafsknochengewebeprobe mit einem ausgezeichneten S / N trotz einer relativ kurzen Erfassungszeit (d. h. 9 Stunden) zu erhalten (Abb. 1C, D). Die verschiedenen chemischen 1H-Umgebungen von Bone Mineral sind jetzt leicht beobachtbar und können sicher und präzise analysiert werden. In Bezug auf den inneren kristallinen Kern von Knochenmineralpartikeln werden die im Kristallgitter des Hydroxylapatits vorhandenen Hydroxylionen in Form einer komplexen Resonanz beobachtet, die bei δ (1H) = 0,0 ppm zentriert ist. In Bezug auf ihre amorphe Oberflächenschicht sind strukturelle Wassermoleküle und saure Phosphatspezies, die in nicht-apatitischen Umgebungen vorhanden sind, in Form einer einzigen Resonanz bei δ (1H) = 5 zu beobachten.2 ppm und eine breite Resonanz im Bereich von δ(1H) = 7 bis 17 ppm32.

Nachweis wasserstoffhaltiger Spezies in Knochenmineralien. 1H-31P kreuz polarisation (CP) basierend magie winkel spinning (MAS) solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spektren von eine trockene 2-jahr-alte schafe knochen gewebe probe. (A) zweidimensionales (2D) {1H} 31P Heteronukleares Korrelationsspektrum (HetCor) (Kontaktzeit, tCP = 1000 µs). Die Signalintensität steigt von Blau auf Rot. (B) 1H-Projektion der vertikalen (F1) Dimension des in (A) gezeigten 2D {1H}31P HetCor-Spektrums. {1H-31P}1H-Doppel-CP-MAS-Spektren, aufgenommen mit den folgenden Kontaktzeiten: (C) tCP1 = tCP2 = 1000 µs; und (D) tCP1 = tCP2 = 15000 µs. Die gesamte Versuchszeit war in jedem Experiment gleich (d. H. 9 Stunden).

Zweitens erlaubt dieses Experiment die Untersuchung der 1H-detektierten CP-Dynamik, um selektiv die Natur der 1H-Kerne in der Nähe von 31P-Kernen aufzudecken. Dazu wurde die Kontaktzeit 1 (tCP1) auf 1000 µs fixiert gehalten, während die Kontaktzeit 2 (tCP2) von 75 µs bis 1000 µs variiert wurde (Fig. 2). Sowohl für die bei δ (1H) = 0,0 zentrierten Resonanzen als auch für δ (1H) = 5,2 ppm (siehe die schwarzen gestrichelten Linien) wird ein gleichmäßiger Anstieg der Magnetisierung beobachtet, der zuvor OH−Ionen und strukturellen H2O-Molekülen entsprechend ihrer jeweiligen chemischen 1H-NMR-Verschiebung zugeschrieben wurde. Demgegenüber zeigt die Entwicklung des breiten Signals im Bereich von δ(1H) = 7-17 ppm zunächst einen raschen Anstieg seiner Magnetisierung (bis tCP2 = 300 µs) und es folgt das Vorliegen eines Schwingungsverhaltens (bis tCP2 = 1250 µs – siehe schwarze gestrichelte Linie). Dieses Schwingungsverhalten ist charakteristisch für 1H-31P dipolare (DP-H) Schwingungen55,56. Die Anpassung der entsprechenden {1H-31P} 1H ssNMR-Spektren an verschiedenen tCP2 ist aufgrund der Überlappung verschiedener Resonanzen nicht einfach. Während synthetische HA-Proben in der Regel eine symmetrische OH-Resonanz32 aufweisen; wir zeigen hier, dass die OH−Resonanz von Knochenmineral besonders komplex ist und wie folgt angepasst werden kann: ein Hauptpeak bei δ(1H) = 0,0 ppm umgeben von zwei Schulterpeaks bei δ(1H) = -0,7 und 0,9 ppm (Abb. S3). Die Reststrukturwasserresonanz kann mit einem einzigen Peak bei δ (1H) = 5,2 ppm richtig eingestellt werden (Abb. S4). Demgegenüber kann das im Bereich von δ(1H) = 7-17 ppm beobachtbare breite Signal der sauren Phosphatspezies insbesondere bei kurzen Kontaktzeiten nicht zufriedenstellend mit einem einzigen Peak mit fester Position und Linienbreite ausgestattet werden (siehe die besten Anpassungsergebnisse für die verschiedenen tCP2-Werte in Fig. S4 – linke Spalte). Die Anpassungsergebnisse sind jedoch genau, wenn zwei verschiedene Peaks mit festen Positionen und festen Linienbreiten (6,2 ± 0,1 bzw. 5,0 ± 0,1 ppm) verwendet werden (Abb. S4 – rechte Spalte). Wir können nicht behaupten, dass dieses breite Signal nur aus zwei Peaks besteht, die zwei verschiedenen Protonenumgebungen entsprechen, aber es besteht wahrscheinlich aus einer breiten Verteilung chemischer Umgebungen, die zu einer Verteilung chemischer NMR-Verschiebungen führen. Entsprechend zeigt Fig. 3A zeigt die vier Peaks, die zur Analyse der 31P-gefilterten 1H ssNMR-Spektren von Knochenmineral für jeden tCP2-Wert verwendet wurden: (i) ein zusammengesetzter Peak mit δ (1H) = 0,0 (violett) und ein einzelner Peak mit δ (1H) = 5,2 (grau) ppm, die beide durch ein relativ langsames und gleichmäßiges Wachstum ihrer Magnetisierungen gekennzeichnet sind; und (ii) zwei Peaks bei δ (1H) = 9,8 (blau) und 14,0 (grün) ppm, die beide dipolare Schwingungen anzeigen (Abb. 3B). In Bezug auf diese beiden letztgenannten Peaks ist die genaue Übereinstimmung des Hartmann-Hahn-Profils (H-H) (Abb. S2) ermöglicht die numerische Modellierung der CP-Aufbaukurven nach dem Single-Spin-Paar-Modell unter Berücksichtigung dipolarer Schwingungen infolge kohärenter Polarisationsübertragung und des Einflusses der 1H-Spindiffusion57:

Quantifizierung von HPO42− Ionen in Knochenmineral

Die Quantifizierung der in Knochenmineral vorhandenen HPO42− Ionen wurde durchgeführt. Dazu wurden die Linienform und Linienbreite der einzelnen 31P−NMR-Signale des OH- und PO43-haltigen inneren kristallinen Kerns und der H2O- und HPO42-haltigen nicht-apatitischen Umgebungen (amorphe Oberflächenschicht), die in Fig. 4B, wurden bei der Anpassung des quantitativen 31P Single Pulse (SP) MAS ssNMR Spektrums einer frischen 2 Jahre alten Schafsknochengewebeprobe (Fig. 5A). Der molare prozentuale Anteil von HPO42− und PO43- Ionen im Knochenmineral betrug etwa 50/50 ± 5%. Wie unsere Beobachtungen in den Figuren S9 und S10 nahelegen, wurde diese Berechnung unter der Annahme durchgeführt, dass der molare Anteil von HPO42− Ionen im inneren kristallinen Kern der Partikel nahe bei 0% lag. Ein derart hoher molarer Anteil an HPO42- Ionen in der amorphen Oberflächenschicht spiegelt die geringe Größe der Knochenmineralpartikel wider: ∼ 1-5 nm Dicke, ∼ 10-40 nm Breite und ∼20-100 nm Länge1,61,62,63. Da wir gezeigt haben, dass die HPO42− Ionen in der amorphen Oberflächenschicht konzentriert sind, können wir nun die durchschnittliche Dicke dieser Schicht für eine 2 Jahre alte Schafsknochengewebeprobe abschätzen. Hier betrachten wir ein nanoskaliges Plättchen mit einer Dicke von 4,0 nm und nehmen an, dass die Dichten der Phosphatatome, die im Kristallgitter des Hydroxylapatits und in der amorphen Oberflächenschicht vorhanden sind, äquivalent sind. In einem solchen Szenario beträgt die Dicke des inneren kristallinen Kerns etwa 2,4 nm (d.h., die etwa doppelt so groß ist wie die hexagonale Einheitszelle aus Hydroxylapatit 64 entlang der kristallographischen Achsen a und b; a = b = 0,94 nm); während die Dicke der äußeren amorphen Oberflächenschicht auf etwa 0,8 nm geschätzt werden kann (d. h. die dann der Größe der hexagonalen Einheitszelle aus Hydroxylapatit entlang a und b entspricht und daher der Stapelung von nur zwei Phosphationen entspricht). Man sollte sich bewusst sein, dass dies Durchschnittswerte sind, die der Summe der Beiträge aller anorganischen Phosphationen entsprechen, die in unserer 2-jährigen Schafknochengewebeprobe vorhanden sind. Diese Ergebnisse können für ältere Proben unterschiedlich sein, bei denen der Anteil der nicht apatitischen Umgebungen aufgrund der Knochenmineralreifung geringer sein kann65: die fortschreitende Umwandlung der amorphen Oberflächenschicht in apatitische Umgebungen15. Dennoch stimmt die hier ermittelte Dicke der Oberflächenschicht (0,8 nm) gut mit den in einigen früheren Studien vorgeschlagenen geschätzten Größen überein: etwa die Größe einer Phosphateinheit in Fluorapatit-Gelatine-Mesokristallen 66; und etwa 1-2 nm in synthetischen Hydroxylapatiten 32,67,68.

Quantifizierung von HPO42− und CO32− Ionen in Knochenmineralien. (A) Quantitatives 31P Single Pulse (SP) Magic Angle Spinning (MAS) Solid-State Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) -Spektrum einer frischen 2 Jahre alten Schafsknochengewebeprobe (blaue Linie) und ihrer entsprechenden Anpassung (rote gestrichelte Linie) mit zwei Peaks. Diese beiden Peaks, deren Linienform und Linienbreite in Abb. 4B entsprechen dem PO43-haltigen inneren kristallinen Kern in Form von Hydroxylapatit (orange Peak) und dem HPO42-haltigen nicht-apatitischen Kern in Form einer amorphen Oberflächenschicht (lila Peak). (B) Fourier-Transform-Infrarot (FT-IR) -Spektrum des co2 (CO3) -Vibrationsmodus für eine 2 Jahre alte Schafsknochengewebeprobe (blaue Linie) und ihre entsprechende Anpassung (rote gestrichelte Linie). CO32−Ionen vom Typ B besetzen die PO43-Stellen im Kristallgitter des Hydroxylapatits; CO32−Ionen vom Typ A besetzen die OH-Stellen im Kristallgitter des Hydroxylapatits; während nicht-apatitisches CO32- in der amorphen Oberflächenschicht vorhanden ist, die Knochenmineralpartikel bedeckt.

Update zur chemischen Zusammensetzung von Knochenmineralien

Die hier und anderswo vorgestellten Ergebnisse45 legen nahe, dass die von Legros et al.27, Ca8.3□1,7(PO4)4,3 (HPO4 oder CO3)1,7 (OH oder ½ CO3)0,3□1,7, muss überdacht werden. Tatsächlich ignoriert diese Formel nicht nur das Vorhandensein der amorphen Oberflächenschicht, deren chemische Zusammensetzung in Bezug auf die apatitischen Umgebungen, die im inneren kristallinen Kern der Partikel vorhanden sind, stark variiert, sondern unterschätzt auch den molaren Anteil von HPO42− Ionen. Um eine aktuelle Formel unserer 2 Jahre alten Schafsknochengewebeprobe vorzuschlagen, mussten wir zunächst den Gewichtsanteil von CO32−Ionen bestimmen. Durch FT-IR-Analysen wurde ein Wert von 4,8% mit einem Hauptbeitrag in B-Typ-Carbonaten gefunden49 (Abb. 5B), was den Werten anderer Knochenmineralproben3 entspricht. Darüber hinaus wurden die folgenden Parameter berücksichtigt: (i) Die Partikel müssen elektrisch neutral bleiben (sowohl der innere kristalline Kern als auch die amorphe Oberflächenschicht); (ii) der molare Anteil von HPO42−Ionen relativ zur Gesamtmenge an anorganischen Phosphationen ist gemäß der vorliegenden Studie auf nahe 50% beschränkt; (iii) Der Karbonisierungsgrad sollte nahe am experimentellen Wert liegen (4,8% w / w); (iv) Das Gesamt-Ca / (P + C) -Molverhältnis sollte für eine Knochengewebeprobe akzeptabel bleiben, i.e. im Bereich von 1,2–1,53 und zuletzt (v) sollte der Anteil von A-Typ-, B-Typ- und nicht-apatitischen Carbonationen, die in der amorphen Oberflächenschicht vorhanden sind, in Übereinstimmung mit den FT-IR-Daten bleiben. Sobald alle diese Einschränkungen zusammengeführt wurden, kann die durchschnittliche chemische Zusammensetzung des reifen kortikalen Knochenminerals aus unserer 2 Jahre alten Schafknochengewebeprobe wie folgt angenähert werden: Ca7,5 (PO4) 2, 8 (HPO4) 2, 6 (CO3) 0, 6 (OH) 0, 2. Man sollte beachten, dass diese durchschnittliche chemische Zusammensetzung ausschließlich unserer spezifischen Knochengewebeprobe nach unseren eigenen experimentellen Ergebnissen entspricht. Daher ist diese Formel nicht universell, da bei Knochenproben Variabilität auftritt, insbesondere abhängig von der Art, dem Alter, der Nahrungsversorgung und ihrem Reifegrad.