eksperimentelt design og prøveindsamling

eksperimentet blev oprettet i 1982 i Mengcheng county, Anhui-provinsen, Kina (33 liter 13′ N, 116 liter 35′ E, 42 m højde) med typisk kalksten sort jord. Den årlige temperatur er 14,8 liter C og den årlige nedbør er 872 mm. Fem befrugtningsbehandlinger med hvede-sojabønneafgrøde blev sammenlignet i et fuldstændigt randomiseret blokdesign med fire replikater (hvert plot er 70 m2) : (1) Kontrol, ikke-befrugtning; (2) NPK, NPK kemisk gødning omfattende urinstof (180 kg N ha−1 år−1), superphosphat (90 kg P2O5 ha−1 år−1) og kaliumchlorid (86 kg K2O ha− 1 y−1); (3) NPK + vs, NPK kemisk gødning plus 7500 kg hvedestrå ha−1) år−1; (4) NPK + pm, NPK kemisk gødning plus 15.000 kg frisk svinegødning ha−1 år−1; (5) NPK + CM, NPK kemiske gødninger plus 30.000 kg frisk ko gødning ha−1 år−1. I NPK + vs-behandlingen blev alt hvedestrå returneret til marken, svinegødningen i NPK + PM-behandlingen og Ko-gødningen i NPK + CM havde den samme mængde organisk kulstof med det tilsatte hvedestrå. Desuden har disse kontrasterende gødningstyper, der indgår i vores befrugtningsbehandlinger, forskellige niveauer af tilgængelighed for planter og mikrober, f.eks. Vi brugte en bred vifte af befrugtningsbehandlinger med det formål at gøre vores resultater repræsentative og anvendelige til kontrasterende ledelsespraksis.

vi gravede omkring hvedegruppen (indeholdende 30 Til 40 hvedeplanter under hvedefyldningsfasen den 20.April 2017) for at holde rodsystemerne så intakte som muligt. Jordstænglen, der var tæt klæbet til rødderne, blev derefter børstet. Samtidig blev matjorden (0-15 cm dyb) opsamlet som bulkjord ved hjælp af en sneglekorer (cirka 20 cm væk fra planterne). Den opsamlede jord blev sigtet gennem et 2 mm mesh for at fjerne urenheder såsom rødder og sten. Noget af jorden blev opbevaret ved 4 liter C til kemiske analyser, og resten blev opbevaret ved − 40 liter C til DNA-ekstraktion.

jord fysisk-kemisk analyse

en pH-meter (FE20 FiveEasy liter, Mettler Toledo, Tyskland) blev brugt til at måle jordens pH ved et jord til destilleret vandforhold på 1:5 (vægt / volumen). Jordfugtigheden blev bestemt gravimetrisk ved tørring af 5 g frisk jord ved ca.105-108 liter C for at nå en konstant vægt og derefter beregne vægtforholdet (fordampet vand til tørret jord). Jordens samlede kulstofindhold (TC) og samlede nitrogen (TN) blev bestemt ved forbrænding af lufttørret jord ved hjælp af en CNS-2000 analysator (LECO, St. Joseph, MI, USA) efter sigtning af jorden gennem et 0,15 mm mesh. Jordens samlede fosfor (TP) og samlede kaliumindhold (TK) blev ekstraheret efter HF-HClO4 fordøjelse og målt ved hjælp af henholdsvis molybdænblå metode og flammespektrofotometri (FP640, INASA, Kina). Opløst organisk kulstof (DOC) blev ekstraheret ved tilsætning af 50 mL destilleret vand til 5 g frisk jord, omrystning i 1 time og vakuumfiltrering gennem et G4-glasfiberfilter med et porerum på 1,2 liter (Fisher), og derefter blev kulstofindholdet i ekstrakterne bestemt af en total organisk kulstofanalysator (multi N/C 3000, Analytik Jena, Tyskland). Nitrat (NO3–N), ammonium (NH4+-N) og opløst Total nitrogen (DTN) blev ekstraheret i et forhold på 5 g frisk jord til 50 mL 2 M KCl. Efter shacking i 1 time blev ekstrakterne filtreret gennem et G4-glasfiberfilter med et porerum på 1,2 liter (Fisher), og derefter blev et kontinuerligt strømningsanalysesystem (San++ system, Skalar, Holland) brugt til at analysere indholdet af NO3–N, NH4+-N og DTN. Opløst organisk nitrogen (DON) blev beregnet ved hjælp af følgende formel: DON = DTN − NH4+-N − NO3–N. Det tilgængelige fosfor (AP) i jorden blev ekstraheret med 0.5 M NaHCO3 og bestemmes ved hjælp af molybdæn blå metode. Tilgængelig kalium (AK) blev ekstraheret med 1 M ammoniumacetat og bestemt ved flammefotometer (FP640, INASA, Kina) (yderligere fil 3: tillæg 1).

bestemmelse af kvælstoffikseringshastigheder

15n2-mærkningsmetoden er en af de mest almindelige og udbredte metoder, der anvendes til måling af N-fikseringshastigheder . Fem gram jord blev anbragt i 18 liter 150 mm Balch rør, og headspace blev erstattet med syntetisk luft indeholdende 80% 15n2 og 20% O2. Kontrollerne blev fyldt med umærket N2-gas og behandlet parallelt. Rørene blev inkuberet vandret i mørke ved stuetemperatur i 22 dage. Atomet % 15N af jordprøver blev bestemt ved anvendelse af et stabilt isotopforhold massespektrometer (Flash 2000 HT/Conflo IV/Delta V, Thermo Fisher Scientific, Tyskland). Derefter, vi beregnet nettopotentialet n fikseringshastighed ved at sammenligne forskellen på total 15N i jord, der modtager 15n2 i forhold til kontrol.

high-throughput sekventering og bioinformatik analyse

til DNA-ekstraktion, 0.5 g frisk jord blev brugt med Fast DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). NifH-generne blev amplificeret ved anvendelse af primerpar nifH-F/nifH-R (5′-AAAGGYGGVANDCGGYAARTCCACCAC-3′) / (5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′) . PCR-reaktioner blev udført i en 20 µL reaktion, der indeholder 4 µL 5 × FastPfu buffer, 2 µL af 2,5 mM dntp ‘ er, 0.8 µL 5 µM frem primer, 0.8 µL 5 µM omvendt primer, 0.4 µL fastPfu Polymerase, 10 ng af template-DNA, og dobbelt-destilleret vand (ddH2O). Amplifikation blev udført ved 95 liter C i 3 minutter, med 35 cyklusser på 95 liter C i 30 sekunder, 55 liter C i 30 sekunder og 72 liter C i 45 sekunder og forlængelse ved 72 liter C i 10 minutter. PCR-amplikoner blev oprenset ved hjælp af agarosegel DNA-rensningssæt (TaKaRa Bio), og triplicate PCR-amplifikationer for hver prøve blev udført og samlet som et PCR-produkt og derefter sekventeret på platformen af Illumina Misek PE300 (Majorbio Company i Shanghai, Kina). Efter sekventering blev nifH-nukleotidsekvenserne analyseret ved hjælp af CHIIME-1.9.1-rørledningen (http://qiime.sourceforge.net/) . For det første blev sekvenserne af lav kvalitet (dem med et kvalitetsresultat < 20, der indeholdt tvetydige nukleotider eller ikke matchede primeren og stregkoden) fjernet, og de resterende sekvenser blev yderligere konverteret til aminosyresekvenser ved hjælp af Fungenrørledningen i ribosomalt databaseprojekt . Sekvenserne, der koder for proteiner, der ikke matchede nifH-proteinsekvensen, eller som indeholdt termineringskodoner, blev kasseret. De resterende sekvenser blev justeret mod nifH-gendatabasen og fjernede både de mislykkede og kimære sekvenser. De resterende sekvenser af høj kvalitet blev grupperet i operationelle taksonomiske enheder (OTU ‘er) ved 95% lighed med UCLUST, der kører i de novo-tilstand, og alle Singleton OTU’ er blev slettet.

Co-forekomst netværksanalyse

Vi konstruerede et co-forekomst netværk med alle prøverne (jordstængler og bulkjord) og identificerede de vigtigste økologiske klynger af stærkt tilknyttet OTUs. De øverste OTU ‘ er, der tegner sig for mere end 80% af den relative overflod i det samlede samfund, blev valgt . Alle parvis Spearman-korrelationer mellem OTU ‘ er blev beregnet, og korrelationerne med en Spearmans koefficient på mindre end 0,65 og en P-værdi på mere end 0,01 blev fjernet. Dette tillod os kun at fokusere på OTUs, der stærkt opstod og var mere tilbøjelige til at interagere med hinanden. Hovedmodulerne (økologiske klynger) i netværket blev visualiseret ved hjælp af Gephi (https://gephi.org/). Den relative overflod af hver økologisk klynge blev beregnet ved at beregne gennemsnittet af de standardiserede relative overflod (å-score) af de arter, der tilhørte den (yderligere fil 3: Tillæg 3).

statistisk analyse

ANOVA-og parvise t-tests blev brugt til at sammenligne jordvariablerne, dominerende mikrobielle taksa og den mikrobielle alfa-mangfoldighed mellem forskellige befrugtningsbehandlinger (yderligere fil 3: tillæg 1). Disse tests blev implementeret ved hjælp af SPSS 21. Mantel test blev brugt til at analysere korrelationerne mellem det diasotrofiske samfund og fysisk-kemiske egenskaber (yderligere fil 3: tillæg 2). Dette blev udført ved hjælp af” vegan ” – pakken i r LR 32 (3.2.2). En hovedkoordinatanalyse (pcoa) blev brugt til at finde signifikante forskelle i diasotrofiske samfund mellem prøveudtagningsgrupper (yderligere fil 3: tillæg 2). PCoA blev udført ved hjælp af “labdsv” – pakken r prist 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

fylogenetiske analyser

nifH-genet giver tilstrækkelig fylogenetisk opløsning i økologiske undersøgelser. Det fylogenetiske træ for de 481 dominerende diasotrofe fylotyper i de økologiske klynger blev bygget ved hjælp af FastTree og visualiseret ved hjælp af GraPhlAn . Fylogenetisk prøveudtagningsteori kan anvendes analytisk (forudsat tilfældig prøveudtagning fra det fylogenetiske træ som den forudsagte fylogenetiske mangfoldighed i et lokalsamfund og derefter sammenligne den observerede fylogenetiske mangfoldighed med disse forudsigelser) for at bestemme, i hvilken grad diasotrofisk samfund forekommer tilfældigt (mellem − 2 og + 2), overdispergeret (over + 2) eller grupperet (under-2). Fylogenetisk prøveudtagningsteori blev udført under anvendelse af R-pakken “picante” . En fordel ved tilfældigt prøveudtagning af det regionale fylogenetiske træ er, at det kan bruges til at sammenligne prøver af ulige størrelser baseret på binomial prøveudtagningsmodel . Forskellene mellem observeret og forventet fylogenetisk mangfoldighed blev bestemt ved at beregne og sammenligne å-score for hver økologisk klynge. Når den observerede fylogenetiske mangfoldighed er mindre end den forventede mangfoldighed (under − 2), anses det mikrobielle samfund i den økologiske klynge for at være fylogenetisk grupperet, hvilket betyder, at nært beslægtede takser er mere tilbøjelige til at blive udtaget og aktivt udvalgt af miljøet .

strukturel ligningsmodelleringsanalyse

SEM blev udført ved hjælp af IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation). Det blev brugt til at evaluere de direkte og indirekte virkninger af jordens fysisk-kemiske egenskaber og den relative overflod af de vigtigste økologiske klynger på N-fikseringshastighederne. Jordens fysiokemiske egenskaber omfattede jordens pH, total kulstof, total nitrogen og total fosfor. I modellen var behandlingerne (kontrol, NPK, NPK + vs, NPK + PM og NPK + CM) kategoriske variabler med to niveauer: 1 (en bestemt behandling) og 0 (resterende betragtede behandlinger). Derudover blev bootstrapping brugt til at teste sandsynligheden for, at sti-koefficienter adskiller sig fra nul, da nogle få af variablerne ikke normalt blev fordelt. Vi beregnede også de standardiserede samlede effekter (STEs) af jordegenskaberne, befrugtningsbehandlinger og jordstængeleffekt på N-fikseringshastigheden for at hjælpe fortolkningen af SEM.

tilfældig Skovmodelleringsanalyse

tilfældig Skovregression (r-pakke “randomForest”) blev brugt til at regressere den normaliserede OTUs i forskellige behandlinger. Den 10 gange krydsvalideringsmetode blev brugt til at bestemme det optimale sæt OTU ‘ er korreleret med N-fikseringshastighederne . Rangerede lister over OTU ‘ er i rækkefølge efter tilfældige skove rapporterede funktionsværdier blev opnået baseret på stigningen i middelkvadratfejl i kvælstoffikseringshastigheder forudsagt over 100 iterationer af algoritmen. De 50 markør-OTU ‘ er blev valgt ud fra de mindste gennemsnitlige krydsvalideringsgennemsnitlige kvadrerede fejl, som blev opnået fra fem forsøg med den 10 gange krydsvalidering.