knoglemineral: ny indsigt i dets kemiske sammensætning
identifikation af HPO4 2− ioner i knoglemineral
det direkte faststof-kernemagnetisk resonans (ssNMR) påvisning af protoner lokaliseret i knoglemineralt fra en intakt knoglevævsprøve er ikke mulig. Dette skyldes tilstedeværelsen af den ekstracellulære organiske matrice, hvis forskellige signaler dominerer 1h single pulse (SP) ssNMR-spektret af en knoglevævsprøve54. Muligheden for at afsløre atomskala rumlige proksimiteter blandt hydrogen-og fosforkerner i det todimensionale (2D) {1h}31P Heteronukleære korrelation (HetCor) ssnmr-eksperiment muliggør sondering af knoglemineralhydrogenmiljøer gennem analysen af F1-dimensionen (Fig. 1A). Desværre er dette eksperiment tidskrævende og giver anledning til en 1h-projektion af den lodrette (F1) dimension med et relativt dårligt signal/støjforhold (S / N) og en lav digital opløsning (Fig. 1B). For at overvinde disse begrænsninger brugte vi det endimensionelle (1D) {1h-31P}1h dobbelt krydspolarisering (CP) ssNMR eksperiment. Den består af en dobbelt CP-overførsel udført på en “der-og-tilbage” måde (1 h-31P-1H) (Fig. S1). For det første tillod dette eksperiment os at opnå 31P-filtrerede 1h ssNMR-spektre af knoglemineral fra en intakt, kortikal 2-årig fårbenvævsprøve med en fremragende S/N på trods af en relativt kort erhvervelsestid (dvs.9 timer) (Fig. 1C, D). De forskellige 1h kemiske miljøer fra knoglemineraler er nu let observerbare og kan analyseres sikkert med præcision. Med hensyn til den indre krystallinske kerne af knoglemineralpartikler observeres de hydroksylioner, der er til stede i hydroksyapatitens krystalgitter, i form af en kompleks resonans, der er centreret ved KRP(1h) = 0,0 ppm. Med hensyn til deres amorfe overfladelag er strukturelle vandmolekyler og sure fosfatarter, der er til stede i ikke-apatitiske miljøer, observerbare i form af en enkelt resonans centreret ved KRP(1h) = 5.2 ppm og en bred resonans, der spænder fra henholdsvis kr. (1h) = 7 til 17 ppm32.
for det andet tillader dette eksperiment undersøgelsen af den 1h-detekterede CP-dynamik for selektivt at afsløre arten af 1h-kernerne i nærheden af 31P-kerner. Til dette formål blev kontakttiden 1 (tCP1) holdt fast til 1000 liter, mens kontakttiden 2 (tCP2) varierede fra 75 liter op til 1000 liter (Fig. 2). En ensartet stigning i magnetiseringen observeres for både resonanserne centreret ved kurr(1h) = 0,0 og kurr(1h) = 5,2 ppm (se de sorte stiplede linjer), der tidligere blev tilskrevet OH− ioner og strukturelle H2O-molekyler i henhold til deres respektive 1H NMR kemiske skift. I modsætning hertil viser udviklingen af det brede signal i området for KRP(1h) = 7-17 ppm oprindeligt en hurtig stigning i dens magnetisering (op til tCP2 = 300 KRP) og efterfølges af tilstedeværelsen af en oscillerende opførsel (op til tCP2 = 1250 KRP – se den sorte stiplede linje). Denne oscillerende adfærd er karakteristisk for 1h-31P dipolære (DP-H) svingninger55,56. Tilpasningen af de tilsvarende {1h-31P}1h ssNMR spektre ved forskellige tCP2 er ikke ligetil på grund af overlapning af forskellige resonanser. Mens syntetiske HA-prøver normalt udviser en symmetrisk OH-resonans32; vi viser her, at Oh-resonansen af knoglemineral er særlig kompleks og kan monteres som følger: en hovedtop ved KRP(1h) = 0,0 ppm omgivet af to skuldertoppe ved KRP(1h) = -0,7 og 0,9 ppm (Fig. S3). Den resterende strukturelle vandresonans kan være korrekt udstyret med en enkelt top centreret ved liter(1h) = 5,2 ppm (Fig. S4). I modsætning hertil kan det brede signal fra de sure fosfatarter, der kan observeres i området for kur(1h) = 7-17 ppm, ikke forsynes tilfredsstillende med en enkelt top med fast position og linjebredde, især ved korte kontakttider (se de bedste tilpasningsresultater for de forskellige tcp2-værdier i Fig. S4-venstre kolonne). Tilpasningsresultaterne er imidlertid nøjagtige, når der anvendes to forskellige toppe med faste positioner og fastlinjebredder (henholdsvis 6,2 liter 0,1 og 5,0 liter 0,1 ppm) (Fig. S4-højre kolonne). Vi kan ikke hævde, at dette brede signal kun er sammensat af to toppe svarende til to forskellige protonmiljøer, men det er sandsynligvis sammensat af en bred fordeling af kemiske miljøer, der fører til en fordeling af NMR kemiske skift. Følgelig Fig. 3A viser de fire toppe, der blev brugt til at analysere de 31P-filtrerede 1h ssNMR-spektre af knoglemineral for hver tCP2-værdi: (i) en sammensat top centreret ved KRP (1h) = 0,0 (lilla) og en enkelt top centreret ved KRP(1h) = 5,2 (grå) ppm begge kendetegnet ved en relativt langsom og ensartet vækst af deres magnetiseringer; og(ii) to toppe ved liter (1h) = 9,8 (blå) og 14,0 (grøn) ppm begge viser dipolære svingninger (Fig. 3B). Med hensyn til disse to sidstnævnte toppe er den nøjagtige match af Hartmann-Hahn (H-H) profil (Fig. S2) muliggør numerisk modellering af CP-opbygningskurverne i henhold til single spin pair-modellen, der tegner sig for dipolære svingninger som følge af sammenhængende polarisationsoverførsel og virkningen af 1h spin diffusion57:
kvantificering af HPO4 2− ioner i knoglemineral
kvantificeringen af HPO42− ioner til stede i knoglemineralblev foretaget. Til dette formål linieformen og liniebredden af de individuelle 31P NMR− signaler fra OH-og PO43-indeholdende intern krystallinsk kerne og H2O og HPO42-indeholdende ikke-apatitiske miljøer (amorft overfladelag), der blev afsløret i Fig. 4B, blev anvendt til montering af det kvantitative 31P single pulse (SP) MAS SSNMR-spektrum af en frisk 2-årig fårbenvævsprøve (Fig. 5A). Den molære procentvise andel af HPO42− og PO43-ioner i knoglemineraler viste sig at være omkring 50/50 liter 5%. Som foreslået af vores observationer i fig S9 og S10 blev denne beregning foretaget under forudsætning af, at den molære andel af HPO42− ioner i partiklernes indre krystallinske kerne var tæt på 0%. En sådan høj molar andel af HPO42-ioner, der er til stede i det amorfe overfladelag, afspejler den lille størrelse af knoglemineralpartikler: 1-5 nm i tykkelse,10-40 nm i bredde og 20-100 nm i længden1,61,62, 63. Da vi viste, at HPO42− ionerne er koncentreret i det amorfe overfladelag, kan vi nu estimere den gennemsnitlige tykkelse af dette lag for en 2-årig fårbenvævsprøve. Her betragter vi en nanosiseret blodplade med en tykkelse på 4,0 nm, og vi antager, at densiteterne af fosfatatomer, der er til stede i hydroksyapatitens krystalgitter og i det amorfe overfladelag, er ækvivalente. I et sådant scenario er tykkelsen af den indre krystallinske kerne omkring 2,4 nm (dvs. 64 langs de krystallografiske akser A og b; A = b = 0,94 nm); mens tykkelsen af det ydre amorfe overfladelag kan estimeres til at være omkring 0,8 nm (dvs.som derefter svarer til størrelsen af den sekskantede enhedscelle af hydroksyapatit langs a og b, og dermed svarer til stabling af kun to fosfationer). Man bør være opmærksom på, at disse er gennemsnitsværdier, der svarer til summen af bidragene fra alle de uorganiske fosfationer, der er til stede i vores 2-årige fårbenvævsprøve. Disse resultater kan være forskellige for ældre prøver, hvor andelen af de ikke-apatitiske miljøer kan være mindre65 på grund af knoglemineralmodning: den progressive transformation af det amorfe overfladelag til apatitiske miljøer15. Ikke desto mindre er tykkelsen af overfladelaget bestemt her (0,8 nm) i god overensstemmelse med de estimerede størrelser foreslået i nogle tidligere undersøgelser: om størrelsen af en fosfatenhed i fluorapatit-gelatine mesokrystaller66; og omkring 1-2 nm i syntetiske hydroksyapatiter32,67,68.