Articles

knoglemineral: ny indsigt i dets kemiske sammensætning

identifikation af HPO4 2− ioner i knoglemineral

det direkte faststof-kernemagnetisk resonans (ssNMR) påvisning af protoner lokaliseret i knoglemineralt fra en intakt knoglevævsprøve er ikke mulig. Dette skyldes tilstedeværelsen af den ekstracellulære organiske matrice, hvis forskellige signaler dominerer 1h single pulse (SP) ssNMR-spektret af en knoglevævsprøve54. Muligheden for at afsløre atomskala rumlige proksimiteter blandt hydrogen-og fosforkerner i det todimensionale (2D) {1h}31P Heteronukleære korrelation (HetCor) ssnmr-eksperiment muliggør sondering af knoglemineralhydrogenmiljøer gennem analysen af F1-dimensionen (Fig. 1A). Desværre er dette eksperiment tidskrævende og giver anledning til en 1h-projektion af den lodrette (F1) dimension med et relativt dårligt signal/støjforhold (S / N) og en lav digital opløsning (Fig. 1B). For at overvinde disse begrænsninger brugte vi det endimensionelle (1D) {1h-31P}1h dobbelt krydspolarisering (CP) ssNMR eksperiment. Den består af en dobbelt CP-overførsel udført på en “der-og-tilbage” måde (1 h-31P-1H) (Fig. S1). For det første tillod dette eksperiment os at opnå 31P-filtrerede 1h ssNMR-spektre af knoglemineral fra en intakt, kortikal 2-årig fårbenvævsprøve med en fremragende S/N på trods af en relativt kort erhvervelsestid (dvs.9 timer) (Fig. 1C, D). De forskellige 1h kemiske miljøer fra knoglemineraler er nu let observerbare og kan analyseres sikkert med præcision. Med hensyn til den indre krystallinske kerne af knoglemineralpartikler observeres de hydroksylioner, der er til stede i hydroksyapatitens krystalgitter, i form af en kompleks resonans, der er centreret ved KRP(1h) = 0,0 ppm. Med hensyn til deres amorfe overfladelag er strukturelle vandmolekyler og sure fosfatarter, der er til stede i ikke-apatitiske miljøer, observerbare i form af en enkelt resonans centreret ved KRP(1h) = 5.2 ppm og en bred resonans, der spænder fra henholdsvis kr. (1h) = 7 til 17 ppm32.

Figur 1
figur1

påvisning af hydrogenbærende arter i knoglemineralstof. 1h-31P krydspolarisering (CP) baseret magic angle spinning (MAS) solid state kernemagnetisk resonans (ssNMR) spektre af en tør 2-årig fårbenvævsprøve. (A) todimensionelt (2D) {1h}31P Heteronuklear korrelation (HetCor) spektrum (kontakttid, tCP = 1000 liter). Signalintensiteten stiger fra blå til rød. (B) 1h projektion af den lodrette (F1) dimension af 2D {1H}31P hetcor spektrum vist i (a). {1h-31P}1h dobbelt CP MAS-spektre optaget med følgende kontakttider: (C) tCP1 = tCP2 = 1000 liter; og, (D) tCP1 = tCP2 = 15000 liter. Den samlede eksperimentelle tid var den samme i hvert eksperiment (dvs.9 timer).

for det andet tillader dette eksperiment undersøgelsen af den 1h-detekterede CP-dynamik for selektivt at afsløre arten af 1h-kernerne i nærheden af 31P-kerner. Til dette formål blev kontakttiden 1 (tCP1) holdt fast til 1000 liter, mens kontakttiden 2 (tCP2) varierede fra 75 liter op til 1000 liter (Fig. 2). En ensartet stigning i magnetiseringen observeres for både resonanserne centreret ved kurr(1h) = 0,0 og kurr(1h) = 5,2 ppm (se de sorte stiplede linjer), der tidligere blev tilskrevet OH− ioner og strukturelle H2O-molekyler i henhold til deres respektive 1H NMR kemiske skift. I modsætning hertil viser udviklingen af det brede signal i området for KRP(1h) = 7-17 ppm oprindeligt en hurtig stigning i dens magnetisering (op til tCP2 = 300 KRP) og efterfølges af tilstedeværelsen af en oscillerende opførsel (op til tCP2 = 1250 KRP – se den sorte stiplede linje). Denne oscillerende adfærd er karakteristisk for 1h-31P dipolære (DP-H) svingninger55,56. Tilpasningen af de tilsvarende {1h-31P}1h ssNMR spektre ved forskellige tCP2 er ikke ligetil på grund af overlapning af forskellige resonanser. Mens syntetiske HA-prøver normalt udviser en symmetrisk OH-resonans32; vi viser her, at Oh-resonansen af knoglemineral er særlig kompleks og kan monteres som følger: en hovedtop ved KRP(1h) = 0,0 ppm omgivet af to skuldertoppe ved KRP(1h) = -0,7 og 0,9 ppm (Fig. S3). Den resterende strukturelle vandresonans kan være korrekt udstyret med en enkelt top centreret ved liter(1h) = 5,2 ppm (Fig. S4). I modsætning hertil kan det brede signal fra de sure fosfatarter, der kan observeres i området for kur(1h) = 7-17 ppm, ikke forsynes tilfredsstillende med en enkelt top med fast position og linjebredde, især ved korte kontakttider (se de bedste tilpasningsresultater for de forskellige tcp2-værdier i Fig. S4-venstre kolonne). Tilpasningsresultaterne er imidlertid nøjagtige, når der anvendes to forskellige toppe med faste positioner og fastlinjebredder (henholdsvis 6,2 liter 0,1 og 5,0 liter 0,1 ppm) (Fig. S4-højre kolonne). Vi kan ikke hævde, at dette brede signal kun er sammensat af to toppe svarende til to forskellige protonmiljøer, men det er sandsynligvis sammensat af en bred fordeling af kemiske miljøer, der fører til en fordeling af NMR kemiske skift. Følgelig Fig. 3A viser de fire toppe, der blev brugt til at analysere de 31P-filtrerede 1h ssNMR-spektre af knoglemineral for hver tCP2-værdi: (i) en sammensat top centreret ved KRP (1h) = 0,0 (lilla) og en enkelt top centreret ved KRP(1h) = 5,2 (grå) ppm begge kendetegnet ved en relativt langsom og ensartet vækst af deres magnetiseringer; og(ii) to toppe ved liter (1h) = 9,8 (blå) og 14,0 (grøn) ppm begge viser dipolære svingninger (Fig. 3B). Med hensyn til disse to sidstnævnte toppe er den nøjagtige match af Hartmann-Hahn (H-H) profil (Fig. S2) muliggør numerisk modellering af CP-opbygningskurverne i henhold til single spin pair-modellen, der tegner sig for dipolære svingninger som følge af sammenhængende polarisationsoverførsel og virkningen af 1h spin diffusion57:

$${\rm{M}}({\rm{t}})={{\rm{M}}}_{0}.{{\rm{t}}}_{{\rm{CP}}} / {{\rm{T}}}_{1 {\RM{\rho }}}({}^{{\rm{1}}} {\rm{H}}). og hydroksylioner position i F1 er blevet opsummeret. (C) 1D 31P CP MAS SSNMR spektrum (tCP = 1000 liter) af en syntetisk octacalciumphosphat (OCP) prøve. P1 til P6 svarer til de seks forskellige fosfatgrupper, der er til stede i OCP-krystalgitteret ifølge Davies et al.60. Den røde stiplede linje markerer den mest intense resonans i signalet fra OCP, som ikke detekteres i knoglemineral (B).

kvantificering af HPO4 2− ioner i knoglemineral

kvantificeringen af HPO42− ioner til stede i knoglemineralblev foretaget. Til dette formål linieformen og liniebredden af de individuelle 31P NMR− signaler fra OH-og PO43-indeholdende intern krystallinsk kerne og H2O og HPO42-indeholdende ikke-apatitiske miljøer (amorft overfladelag), der blev afsløret i Fig. 4B, blev anvendt til montering af det kvantitative 31P single pulse (SP) MAS SSNMR-spektrum af en frisk 2-årig fårbenvævsprøve (Fig. 5A). Den molære procentvise andel af HPO42− og PO43-ioner i knoglemineraler viste sig at være omkring 50/50 liter 5%. Som foreslået af vores observationer i fig S9 og S10 blev denne beregning foretaget under forudsætning af, at den molære andel af HPO42− ioner i partiklernes indre krystallinske kerne var tæt på 0%. En sådan høj molar andel af HPO42-ioner, der er til stede i det amorfe overfladelag, afspejler den lille størrelse af knoglemineralpartikler: 1-5 nm i tykkelse,10-40 nm i bredde og 20-100 nm i længden1,61,62, 63. Da vi viste, at HPO42− ionerne er koncentreret i det amorfe overfladelag, kan vi nu estimere den gennemsnitlige tykkelse af dette lag for en 2-årig fårbenvævsprøve. Her betragter vi en nanosiseret blodplade med en tykkelse på 4,0 nm, og vi antager, at densiteterne af fosfatatomer, der er til stede i hydroksyapatitens krystalgitter og i det amorfe overfladelag, er ækvivalente. I et sådant scenario er tykkelsen af den indre krystallinske kerne omkring 2,4 nm (dvs. 64 langs de krystallografiske akser A og b; A = b = 0,94 nm); mens tykkelsen af det ydre amorfe overfladelag kan estimeres til at være omkring 0,8 nm (dvs.som derefter svarer til størrelsen af den sekskantede enhedscelle af hydroksyapatit langs a og b, og dermed svarer til stabling af kun to fosfationer). Man bør være opmærksom på, at disse er gennemsnitsværdier, der svarer til summen af bidragene fra alle de uorganiske fosfationer, der er til stede i vores 2-årige fårbenvævsprøve. Disse resultater kan være forskellige for ældre prøver, hvor andelen af de ikke-apatitiske miljøer kan være mindre65 på grund af knoglemineralmodning: den progressive transformation af det amorfe overfladelag til apatitiske miljøer15. Ikke desto mindre er tykkelsen af overfladelaget bestemt her (0,8 nm) i god overensstemmelse med de estimerede størrelser foreslået i nogle tidligere undersøgelser: om størrelsen af en fosfatenhed i fluorapatit-gelatine mesokrystaller66; og omkring 1-2 nm i syntetiske hydroksyapatiter32,67,68.

figur 5
figur5

kvantificering af HPO42− og CO32− ioner til stede i knoglemineraler. (A) kvantitativ 31P single pulse (SP) magic angle spinning (MAS) solid state kernemagnetisk resonans (ssNMR) spektrum af en frisk 2-årig fårbenvævsprøve (blå linje) og dens tilsvarende montering (rød stiplet linje) med to toppe. Disse to toppe, hvis linjeform og linjebredde blev afsløret i Fig. 4B, svarer til den PO43-indeholdende indre krystallinske kerne i form af hydroksyapatit (orange peak) og HPO42-indeholdende ikke-apatitiske miljøer i form af et amorft overfladelag (lilla top). (B) Fourier Transform-Infrared(FT-IR)-spektrum af lar2 (CO3)-vibrationstilstanden for en 2-årig fårebenvævsprøve (blå linje) og dens tilsvarende montering (rød stiplet linje). Type B CO32-ioner optager PO43-lokaliteterne i krystalgitteret; type A CO32-ioner optager OH-lokaliteterne i krystalgitteret; mens ikke-apatitisk CO32-er til stede i det amorfe overfladelag, der belægger knoglemineralpartikler.

opdatering af knoglemineralkemisk sammensætning

resultaterne præsenteret her og andet sted45 antyder, at den gennemsnitlige kemiske sammensætning af modent kortikalt knoglemineral foreslået af Legros et al.27, Ca8.3, 1,7(PO4), 4,3(HPO4 eller CO3), 1,7(OH eller CO3), 0,3, 1,7, skal tages op til fornyet overvejelse. Faktisk ignorerer denne formel ikke kun tilstedeværelsen af det amorfe overfladelag, hvis kemiske sammensætning varierer meget med hensyn til de apatitiske miljøer, der er til stede i partiklernes indre krystallinske kerne, men undervurderer også den molære andel af HPO42− ioner. For at foreslå en opdateret formel for vores 2-årige fårbenvævsprøve, vi havde først brug for at bestemme vægtandelen af CO32− ioner. En værdi på 4,8% med et stort bidrag i B-type carbonater blev fundet gennem FT-ir analyser49 (Fig. 5B), som er i overensstemmelse med de fundne værdier for andre knoglemineralprøver3. Derudover blev følgende parametre overvejet: (i) partiklerne skal forblive elektrisk neutrale (både den indre krystallinske kerne og det amorfe overfladelag); (ii) den molære andel af HPO42− ioner i forhold til den samlede mængde uorganiske phosphationer er begrænset tæt på 50% ifølge den foreliggende undersøgelse; (iii) graden af karbonering bør være tæt på den eksperimentelle værdi (4,8% vægt/vægt); (iv) det samlede ca/(P + C) molforhold bør forblive acceptabelt for en knoglevævsprøve, i.e.i området 1,2–1,53 og sidst (v) skal andelen af A-type, B-type og ikke-apatitiske carbonationer, der er til stede i det amorfe overfladelag, forblive i overensstemmelse med FT-ir-dataene. Når alle disse begrænsninger er blevet sammenlagt, kan den gennemsnitlige kemiske sammensætning af det modne kortikale knoglemineral fra vores 2-årige fårbenvævsprøve tilnærmes som følger: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. Man skal bemærke, at denne gennemsnitlige kemiske sammensætning udelukkende svarer til vores specifikke knoglevævsprøve i henhold til vores egne eksperimentelle resultater. Derfor er denne formel ikke universel, da variabilitet forekommer blandt knogleprøver, især afhængigt af arten, alderen, fødevareforsyningen og deres modningsgrad.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret. Krævede felter er markeret med *