introduktion

familiær multipel lipomatose (FML, omim% 151.900) er en sjælden autosomal dominerende lidelse i hypodermis, der er kendetegnet ved udviklingen af velindkapslede subkutane knuder på ekstremiteterne og bagagerummet.1 første rapporter om flere adipocytiske tumorer blev foretaget siden 1846 af Sir Benjamin Brodie.2 senere resultater fra Blaschko (1891) og Alsberg (1892) viste en familiær gentagelse af læsionerne og observerede en øget forekomst blandt mænd.1,3,4 i de efterfølgende år offentliggjorde mange andre forfattere familier med egenskaber, der meget tyder på FML,1,5,6 og endelig i 1970 Das Gupta klassificerede lipomatøse tumorer i tre kategorier: ensom eller sporadisk, FML og Multiple symmetrisk lipomatose (MSL).7,8

ensomme lipomer betragtes som den mest almindelige godartede neoplasma af blødt væv hos voksne, men flere lipomer forekommer hos 5% af individerne.9,10 den nøjagtige prævalens af FML er ukendt, men det er blevet estimeret til at være 0,002%.8,11,12 aldersbegyndelse af knuder er mellem 30 og 40 år og når den maksimale top i 50 ‘ erne.6,8,13,14 det har været almindeligt antaget, at denne lidelse udviser en præference for mænd, men et stort antal værker viser, at begge køn er lige påvirket.15-17 selvom det betragtes som en godartet sygdom, kan kosmetiske bekymringer forekomme hos nogle individer, hvilket forringer deres livskvalitet. Desuden er det også udbredt hos overvægtige personer.9

indtil nu har tilgængelig forskning i FML været eksplicit fokuseret på kliniske aspekter, og molekylære problemer undersøges normalt ikke. Litteraturen antyder, at mindst 70% af sporadiske lipomer skyldes cytogenetiske omlejringer, der involverer båndet 12k13-15, hvilket kan føre til en dereguleret ekspression af hmga2 (høj Mobilitetsgruppe at-hook 2) gen. Dette gen koder for ikke-histoner kromatinproteiner, der er ansvarlige for DNA-konformationsændringer, afvigende celleproliferation og udvikling af godartede mesenkymale tumorer.18-20

anerkendelse af den molekylære base af genetiske tilstande og implementering af sekventeringsteknologier med høj kapacitet har gjort det muligt at udforske og belyse andre mekanismer involveret i etiologien af flere genodermatose. Derfor havde denne undersøgelse til formål at udføre en klinisk og molekylær karakterisering af syv individer med FML for at detektere varianter i seks kandidatgener relateret til lipomatose ved hjælp af Sanger og næste generations sekventeringsteknikker (ngs).

materialer og metoder

patienter og etiske aspekter

denne forskning blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Godkendelse blev indhentet fra det institutionelle Gennemgangsudvalg inden undersøgelsen (Forskningsetikudvalget ved FCM-UNICAMP, fil n luth 1.313.164), og alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke. Vi gennemførte undersøgelsen i poliklinikken for medicinsk genetiktjeneste på det kliniske Hospital ved University of Campinas (HC-UNICAMP) i S. I alt syv personer, der tilhører fem ikke-relaterede familier (navngivet fra A til E) var berettigede. Primære inklusionskriterier for valg af forsøgspersoner var som følger: i) alder over 18 år, ii) klinisk og histopatologisk diagnose af lipom eller angiolipom og iii) familiær gentagelse, der antyder autosomal dominerende arv. De vigtigste kliniske aspekter blev samlet fra lægejournaler ved hjælp af en struktureret form. Fysisk vurdering involverede deltagelse af både dermatolog og genetiker specialiteter. Patologiafdelingen ved HC-UNICAMP leverede de histopatologiske prøver. Kliniske fund er beskrevet i tabel 1.

tabel 1 klinisk oversigt over patienter med FML

Sanger-sekventering af hmga2-genet

genomisk DNA blev ekstraheret fra perifere EDTA-blodprøver fra syv patienter i henhold til den konventionelle phenol-chloroform-procedure anvendt af Sambrook et al21

en polymerasekædereaktion (PCR) blev udført for at forstærke fem kodende eksoner og intron-ekson-krydsregioner i Hmga2 gen. Ved hjælp af to online bioinformatiske værktøjer, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm) og Oligoanalyser 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer) designede vi det specifikke par primere, som opsummeret i tabel 2.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies) efter producentens anvisninger. Kromatogrammer blev undersøgt under anvendelse af Chromas v. 2.6. 5. Resultaterne blev sammenlignet med HMGA2 Ensembl transkriptnummer ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Vi kontrollerede de nye varianter i tre offentlige datasæt: i) Global Alliance for Genomics and Health (GA4GH) Beacon netværk (https://beacon-network.org/#/), ii) Eksomaggregationskonsortiet (http://exac.broadinstitute.org/) og iii) Online arkiv af brasilianske mutationer (http://abraom.ib.usp.br/). For at evaluere patogenicitetsscore og skadeeffekter af nye varianter i kandidat HMGA2-genet brugte vi forskellige i silico-forudsigelsesmodeller som VEP (Variant Effect Predictor), 22 FATHMM (funktionel analyse gennem skjulte Markov-modeller), 23 UMD-predictor,24 SIFT (sortering Intolerant fra Tolerant), 25 PROVEAN (Proteinvariationseffektanalysator), 26 og Mutationstaster.27

mål Multi-Genpanel

et brugerdefineret panel blev udført for at vurdere de gener, der var involveret i syndromisk lipomatose. For at udføre denne teknik opnåede vi genomisk DNA fra spytprøver af fem patienter (A, B, C, D og E) ved hjælp af oragene Relais DNA-selvopsamlingssæt (DNA Genotek, Inc., Ontario, Canada). Prøver blev derefter beriget og hybridiseret mod målspecifikke sekvenser. Indfangningen blev udført ved hjælp af næste generations Illumina-sekvensrækkefølge i 150bp parret sluttilstand i henhold til standardprotokollen for denne platform. Dækningsdybden for målregioner var højere end 50 gange. berigelse og analyse var fokuseret på kodningssekvenserne af fem transkripter (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038.5, MEN1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2 og PTEN NM_000314.4), 10bp af introniske sekvenser og andre regioner, der formodentlig er årsag til sygdom. Eksoniske sletninger, duplikationer og variationer på splejsningsstedet blev også overvejet i forbindelse med undersøgelsen. Læsninger blev justeret og sammenlignet med human genom reference (GRCh37). Multipleks Ligeringsafhængig Sondeforstærkning (MLPA) blev valgt til at validere varianter som nævnt af Invitae prisT Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

datatilgængelighed

sekvenser blev indsendt til GenBank (tiltrædelsesnummer: BankIt2217069 Sek1-MK875826). Datasæt relateret til denne artikel er tilgængelige på European Bioinformatics Institute EMBL-EBI gennem ENA repository med studietiltrædelsesnummer PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

resultater

klinisk analyse

syv personer fra fem ikke-relaterede familier (A, B1, B2, C, D1, D2 og E) blev inkluderet som vist i Figur 1. Vi identificerede ikke forældrenes sammenfald mellem deltagerne. Etnisk oprindelse blev selvrapporteret som blandet af hver proband. I en generel oversigt, familier A og B blev observeret at have tre på hinanden følgende eller flere generationer involveret. Forholdet mellem mand og kvinde blev estimeret til 1:6. Gennemsnitsalderen ved inklusion var 42 år (SD 11,8), mens gennemsnitsalderen for læsionsdebut var 28 år (SD 11,8). Kvinder rapporterede en maksimal forekomst af knuder efter deres graviditeter. Klassiske kliniske træk ved FML inkluderede bløde knuder, der var meget variable i antal og størrelse, placeret i subkutant fedt og begrænset til bagagerummet og ekstremiteterne, som afbildet i figur 2. Ubehag og markant ømhed til palpation blev kun bemærket hos individuelle A. comorbide gastrointestinale lidelser var til stede hos patienter A, C og D2. De rapporterede diverticulitis og polypper, svær kronisk forstoppelse og kolorektal cancer henholdsvis. Fire patienter havde histologisk evaluering af subkutane læsioner. Tilstedeværelsen af modne adipocytter afrundet af adskillige kapillærer bekræftede angiolipomdiagnostik, som henvist til af Bancroft og Fletcher et al10,28 (figur 2). Andre relevante resultater er beskrevet i tabel 1.

Figur 1 Oversigt over stamtavler af familier studeret (A-E). Læg mærke til, hvordan kvinder og mænd er lige involveret, og det autosomale dominerende arvemønster med næsten to på hinanden følgende generationer påvirket. Familie A havde det højeste antal generationer, der udviklede flere lipomer (a). Proband a (III 2) var den eneste inden for hendes familiegruppe og i casuistikken med henvisning til smerte, da den blev undersøgt (a). Pile angiver probands.

figur 2 kliniske egenskaber ved FML og histopatologiske aspekter af lipomer (han pletter (10 liter). Primære fund inkluderer bløde, mobile og omskriver smertefri knuder, der er placeret i subkutant fedt. Den mest almindelige topografiske fordeling omfatter de øvre lemmer (A, B og D), forreste abdominalvæg, ryg og lår (C). Lipoma præsenterer normalt et lobuleret mønster af hvide adipocytter med ensartede kerner og en tynd fibrøs kapsel (E). Angiolipomer er sammensat af modent fedt i forbindelse med adskillige små blodkar, der overvejende er kapillærer. Fibrintrombi (pile) er meget almindelig (F). Billeder med tilladelse fra Institut for patologi og Medicinsk Genetik, School of Medical Sciences, UNICAMP.

Molekylær

Sanger-sekventering afslørede to nye varianter i ekson 5 af HMGA2-genet. Begge varianter blev identificeret i patient A og B1. 327c>T p.(Asp=) betragtes som lav effekt eller neutral, baseret på flere forudsigelsesværktøjer (VEP, FATHMM, UMD-predictor, SIFT, PROVEAN). I modsætning hertil var den anden ændring en nonsensændring heterosygøs variant c.328t>C (s.*110glnæste*16), der forårsager en stopkodonsubstitution med glutamin aminosyre og den efterfølgende forlængelse af det endelige protein (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). Figur 3 skematiserer strukturen af HMGA2-genet, de proteinbindende domæner og de nye varianter.

figur 3 struktur af det humane HMGA2-gen. (A) placeret på 12k14.3, hmga2 gen spænder over mere end 140 kb og omfatter fem eksoner. Ekson 1, 2 og 3 (blå bokse) koder for et at-hook-domæne (blå cirkler). Den fjerde ekson (lilla) koder for et afstandsområde. Ekson 5 (lyserød boks)koder for det C-terminale domæne af proteinet af 109 aminosyrer. (B) Elektroferogram fra patienter A, B1 og reference. To identiske nye varianter blev fundet hos disse patienter. En synonym heterosygøs variant c. 327c>T (s.Asp=) og en no-stop ændring heterosygøs variant c.328t>C (s.*110glnæste*16).

varianten c.328t>C (s.*110glnæste*16) blev defineret som 100% patogen eller høj effekt ifølge nævnt i silico algoritmer. Imidlertid viste forudsigelsessystemet for Mutationsmaster en uoverensstemmelse mellem de to beskrevne varianter, som vist i tabel 3. Det målrettede multi-genpanel af AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA og PTEN i familierne A, B, C, D og E registrerede ikke skadelige ændringer i evaluerede sekvenser.

tabel 3 varianter Fundet I individer A og B1 og sammenligning blandt forudsigelsesværktøjer

diskussion

den aktuelle undersøgelse satte sig for at identificere de molekylære baser af FML gennem integration af moderne sekventeringsteknikker såsom Sanger-sekventering og NGS kombineret med traditionelle kliniske tilgange.

efter tidligere undersøgelser viser den nuværende forskning nogle forskelle med hensyn til epidemiologiske data. Vi observerede, at der er en fælles misforståelse om klassificering og diagnose af forskellige typer lipomatose.7,10,15 flere forfattere understreger,at mænd har en høj tendens til at præsentere flere lipomer,11,29, 30 Vores resultater viser dog en tilsyneladende høj frekvens af FML hos kvinder. Det er muligt, at dette fund kun afspejler en udvælgelsesforstyrrelse på grund af lille stikprøvestørrelse, eller kan også forklares ved, at kvinder er mere tilbøjelige til at søge lægehjælp på grund af kosmetiske bekymringer.31 ikke desto mindre indikerer stamtavlerne, at andelen af individer, der er ramt i begge køn, var ens, hvilket førte til et kønsforhold tæt på 1:1 (10 mænd mod 13 kvinder), som kan undervurdere den sande prævalens af FML.6,8,16 interessant nok var det samlede antal lipomer, der blev noteret hos kvinder, højere sammenlignet med den unikke mand, der blev undersøgt.1,14

faktorer såsom overvægt og forværret vækst af knuder under og efter graviditeter antyder, at eksogene faktorer (diæt), metaboliske ændringer (dyslipidæmi eller ændringer i fedtsyredesaturation) og hormonelle mekanismer kan være involveret i adipocythyperplasi.32,33 Yee et al sammenlignede forskelle i desaturering af stearoyl-CoA mellem personer med sjældne fedtforstyrrelser (RAD) og overvægtige kontrolgruppe og konkluderede, at personer med FML og fedme viste de højeste desatureringshastigheder, hvilket øgede lipogeneseprocessen.32,34

et uventet fund var, at patient A var den eneste inden for den casuistiske og hendes familiegruppe, der manifesterede smerte, daglig svaghed, træthed og psykiatrisk comorbiditet (kronisk depression og angstlidelse). Disse symptomer er stærkt forbundet med Dercums sygdom, som betragtes som en differentiel diagnose eller en variant af FML.35 baseret på den nye dercums sygdomsklassificering foreslået af Hansson et al., 36 identificerede vi hos denne patient den generaliserede nodulære form, kendetegnet ved intens smerte på overfladen af fedtvævet og omkring lipomer. En anden undersøgelse, der understøtter denne hypotese, blev offentliggjort af Campen et al37 de beskrev en familie på ni medlemmer diagnosticeret med flere lipomer, der viste variable symptomer varierede fra total handicap til asymptomatiske knuder. Det kan derfor antages, at adskillelsen følger et autosomalt dominerende mønster med variabel ekspressivitet og muligvis repræsenterer en ekstrem manifestation af FML.

vedrørende den histopatologiske diagnose viste vi to hovedtyper: lipom og angiolipom. Mikroskopisk er det mest almindelige mærkbare træk ved angiolipom spredning af fine blodkar, der indeholder fibrinmikrothrombi i forbindelse med modne adipocytter.10,28 Angiolipomer ser ud til at have en høj forekomst hos unge voksne mænd, der lejlighedsvis manifesterer mild smerte eller ømhed. Denne type tumor er også relateret til historien om lokalt traume eller brugen af steroidbehandling.13,38 selvom mange forfattere anerkender begge diagnoser som forskellige patologiske enheder, skelner nogle sagsrapporter ikke denne forskel på grund af meget subtile forskelle mellem dem.39 i denne sammenhæng bekræfter vores Analyse, at det er muligt at have angiolipomer med familiær gentagelse, og disse diagnoser kan være en del af det brede spektrum af FML.40-43 desuden er flere spindelcellelipomer, en anden type lipom, også rapporteret i flere familier.44

selvom der er flere undersøgelser med fokus på ekspression og direkte cytogenetisk analyse af sporadiske lipomer, har få undersøgelser været bekymrede over forfatningsmæssige årsager til FML.2 omfattende lipoma-serier hos voksne bekræfter flere strukturelle omlejringer med frekvenser fra 50 til 75%.10,28,45 blandt de afbalancerede kromosomale ændringer observeres translokation t(3; 12) (27.kvartal-28; 13. kvartal-15) hos næsten 25% af tumorer.9 i de fleste tilfælde påvirker breakpoint HMGA2-genet, der er sammensat af 5 eksoner og genererer et protein på 109 aminosyrer (figur 3).18,46,47 Ligon et al rapporterede sagen om en otte år gammel dreng med en forfatningsmæssig omlægning, der påvirker bandet 12k14.3 (De novo pericentric inversion) således involverer HMGA2 gen. Imidlertid er den kliniske fænotype karakteriseret ved somatisk overvækst, fremskridt i knogle-og tandalder, cerebellar tumor og flere lipomer, 48 adskiller sig fra vores casuistiske.

vi analyserede de heterosygøse varianter c. 327c>T p.(Asp=) og c.328t>C (s.*110glnæste*16) af ekson 5 af HMGA2-genet i forskellige forudsigelsesprogrammer. Den synonyme eller tavse ændring blev fortolket som godartet, mens ændringen i translation stop codon blev betragtet som 100% patogen eller høj påvirkning. På denne måde kan det tyde på, at ændringer, der involverer den 3-Karri UTR (ikke-oversatte) region, ville udløse den neoplastiske transformation af HMGA2-genet.49 Fusco et al fremhævede hmga2-genets afgørende rolle i mesenkymale tumorer. De foreslog, at i HMGA2-genet, 3-UTR-regionen er generelt tavs af Let-7 miRNA, og enhver ændring på dette niveau, enten trunkering eller fusion med ektopiske sekvenser, drev til dets opregulering og følgelig til en unormal replikation af celler.46

det er noget overraskende, at vi i familie B kun havde opdaget begge nye varianter i moderen (B1). Det kan indikere, at de ikke adskiller sig med FML-fænotype, idet de i det mindste kasseres i denne familie som en etiologisk årsag. På den anden side præsenterede patient a de samme to nye varianter, men demonstrerede en fænotype, der meget tyder på dercums sygdom. På trods af disse lovende fund er de noget vanskelige at fortolke, fordi det ikke var muligt at vurdere andre pårørende, der var berørt af FML.

fokal fedtinfiltration og multiple lipomer kan være til stede i flere syndromer. Proteus syndrom og nelliker (medfødt lipomatøs asymmetrisk overvækst, vaskulære misdannelser, Epidermal nevi, skelet-og spinalanomalier) er eksempler på somatiske mutationer, hvor lipomatose er til stede.50,51 på den anden side er Bannayan-Riley-Rubacalva syndrom, multipel endokrin neoplasi type 1, koden syndrom og Gardner syndrom tilstande som følge af kimlinjemutationer, der har samtidig lipomatose.52-55 selv nogle mutationer, der involverer mitokondriel funktion, er relateret til unormal vækst af fedtvæv mest i den øverste bagagerum og hals, og det bedste eksempel er Madelung-sygdommen.56 imidlertid udelukker det negative panel af AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA og PTEN, at de er ansvarlige for FML-fænotypen, i det mindste i denne forskning.

konklusion

FML er en sjælden og heterogen sygdom, der kan overlappe med andre dermatologiske syndromer, såsom dercums sygdom. FML ‘ s naturlige historie i denne serie afslørede, at udviklingen af læsioner var progressiv og nåede sin højeste forekomst hos middelaldrende individer. FML påvirkede begge køn og præsenterede en topografisk fordeling med overvægt i ekstremiteter og bagagerum. Kønsforholdet blandt evaluerede patienter viste en kvindelig prævalens, men stamtavledata viste en mere afbalanceret fordeling. Diagnosen af Dercums sygdom blev også anerkendt hos et individ (patient A).

den molekylære tilgang har givet en mere dybdegående indsigt i det genetiske grundlag for FML og har forsøgt grundigt at undersøge det største antal kandidatgener, der er knyttet til det. Vi fremhævede nytten af NGS ud over Sanger-metoden i forståelsen af det fulde spektrum af FML, på grund af det kan det tilbyde et alternativ til etiologi identifikation og karakterisering af sjældne genetiske tilstande i kliniske omgivelser. Varianter i ekson 5 af HMGA2-genet er ikke blevet beskrevet, og indtil nu har de en usikker betydning i tilblivelsen af FML. Yderligere undersøgelser, herunder et mere signifikant antal berørte individer og funktionel analyse af de nye varianter af HGMA2-genet, bør udføres for at bestemme dets biologiske funktion i FML bedre.