introduktion

Halofiler er en interessant gruppe af organismer, der trives ved høj saltholdighed. Disse organismer kan bredt klassificeres ud fra deres optimale saltholdighed til vækst i milde halofiler (1-6%, vægt/v NaCl), moderate halofiler (7-15%) og ekstreme halofiler (15-30%) (Madigan og Martinko, 2006). Omfattende forskning har vist, at halofiler ikke er begrænset til nogen af livsdomænerne, de kan være eukaryoter (Gunde-Cimerman et al., 2000; Jørgen et al., 2005), eller prokaryoter, der tilhører domænerne af bakterier og arkæer. Algeslægten Dunaliella og saltlage rejer Artemia (Boetius og Joye, 2009) er eksempler på halofile eukaryoter, mens Halobacterium og Salinibacter er eksempler på halofile prokaryoter. Succes for halofiler i at overleve i meget salte miljøer skyldes unikke fysiologiske tilpasninger, som ionpumpestrategi og organisk opløst stofakkumulering (Oren, 2006; Madigan og Martinko, 2006). På de genomiske og proteomiske niveauer er halofiler kendetegnet ved højt GC-indhold og proteiner kendetegnet ved lav hydrofobicitet, overrepræsentation af sure rester, lavere tilbøjeligheder til spiraldannelse og højere tilbøjeligheder til spiralstruktur (Paul et al., 2008).

Halofiler får nu mere adgang til industriel mikrobiologi og bioteknologi, fordi halofiler vokser ved høj saltkoncentration, og dette minimerer risikoen for forurening under dyrkning (Oren, 2006). Få eksempler på bioteknologiske anvendelser er brugen af Micrococcus varians til fremstilling af nuklease H (Kamekura el Al., 1982) og anvendelsen af de halofile Tetragenococcus-stammer i produktionen af sojasovs og produktionen af visse hydrolaser (amylaser, nukleaser, phosphataser og proteaser) (Oren, 2006). Halofiler er også vigtige i bionedbrydning og bioremediering, da mange halofiler er i stand til at nedbryde kulbrinter og andre giftige forbindelser (Ventosa et al., 1998). Halofiler kan også producere polymerer, der anvendes som forstærkere af oliegenvinding på grund af deres overfladeaktive aktivitet og bioemulgerende egenskaber (Oren, 2006).

Halofiler blomstrer i miljøer, hvor saltholdigheden når høje niveauer, såsom oceaner, solsalterner og naturlige saltsøer (Oren, 2007). Det Døde Hav i Jordan er en af de største virkelig hypersaline indre salt søer i verden (Boetius og Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan og Martinko, 2006). Ud over høj saltholdighed; salt, koncentration på over 340 g L-1 (Oren, 2007), Det Døde Hav er unikt ved dets høje barometertryk (800 mmHg) på grund af meget lav højde under havets overflade, delvis ilttryk (PIO2) på 8% mere end ved havets overflade, unik UV-stråling, lav luftfugtighed (under 40%) og mangel på regn (Avriel et al., 2011).

denne undersøgelse blev udført for at klassificere de halofile heterotrofe bakteriearter, der trives i kystområdet i Det Døde Hav i Jordan. Mikrobiel klassificering er baseret på kolonial og cellemorfologi såvel som lighed i 16S rRNA-gen.

materialer og metoder

prøveudtagning: Døde Hav vandprøver blev indsamlet fra fire kystområder (Fig. 1) i marts, juni og oktober 2011. Geografiske koordinater og forhøjelse af prøvetagningsstederne er vist i tabel 1. Geografiske koordinater og højde blev bestemt for hvert sted ved hjælp af (forklaring C, Danmark). Døde Hav vandprøver blev opsamlet i 1 L ren steril glasflaske efterlader nok plads i hovedet i flasken og transporteres straks til laboratoriet.

fysisk-kemisk analyse af prøverne: Temperatur, pH, samlede opløste faste stoffer (TDS) og biologisk iltbehov (BOD) af vandprøver blev bestemt. Vandtemperatur, pH og saltholdighed blev målt in situ. Vandtemperatur og pH blev målt ved hjælp af en bærbar pH-meter (mikrocomputer pH-meter T19000, Transinstrumenter). Saltholdighed blev målt ved hjælp af et håndholdt saltholdighedsrefraktometer. BOD blev målt i (vand, miljø og tørre regioner Forskningscenter ved Al Al-Bayt University, Jordan). Vandprøver blev overført til en ny glasflaske, derefter blev der tilsat 1 mL phosphatbuffer, magnesiumsulfat, calciumchlorid, jernchloridopløsninger pr. Prøven blev derefter bragt til temperatur 20 liter 3 liter C og mættet med organisk fri filtreret luft. PH-værdien af prøven blev kontrolleret. Hvis prøven ikke var i området 6,5-7,5, blev svovlsyre eller natriumhydroksid tilsat for at bringe prøven til det krævede pH-interval (6,5-7,5), og den tilsatte koncentration fortyndede ikke prøven mere end 0,5%. Prøven blev bragt til temperatur 20 liter C inden fortynding. Passende volumen af prøven blev derefter overført til BOD-flasker. Flasken var fyldt med nok fortyndingsvand til at fortrænge al luft uden at efterlade bobler. Opløst ilt (DO) blev bestemt ved hjælp af en DO-analysator, og ethvert forskudt indhold blev erstattet med fortyndingsvand og prop tæt. Flasken blev inkuberet for 5 dage ved 20 liter C. Efter det, DO blev bestemt, og BOD blev beregnet som følge af forskellen mellem initial og endelig DO over volumen.

berigelse, isolering og gramfarvning: For at berige vandprøver blev Dødehavsvand (10 mL) overført til 90 mL flydende høj saltholdighedsmedium og inkuberet ved 30 kg C i mørke med omrystning (100 o / min). 12 h, en loopful af berigelseskultur blev stribet på modificeret fast mineralsaltmedium, og de adskilte kolonier blev derefter subkultureret. Glycerollagre af isolaterne blev også fremstillet og opbevaret ved -20 liter C til yderligere analyse. Cellerne blev Gram-farvede og undersøgt under mikroskopet.

16S rRNA-gensekventering og analyse: 16S rRNA-gensekvensforstærkning og sekventering blev udført af Macrogen Inc., Seoul, Korea, ifølge følgende metode: unge kolonier af bakteriestammerne blev suspenderet i et 1,5 mL centrifugerør indeholdende 0,5 mL steril saltopløsning og derefter centrifugeret ved 10.000 o / min i 10 minutter supernatanten blev fjernet, og pelleten blev suspenderet i 0,5 mL Instagenmatrice (Bio-Rad, USA) og inkuberet ved 56 kg C i 30 minutter og derefter opvarmet til 100 kg C i 10 minutter. Efter opvarmning blev supernatant anvendt til PCR. PCR blev udført ved at blande 1 liter skabelon-DNA med 20 liter PCR-reaktionsopløsning. 27F / 1492r primere (27F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: 5’-Tac GGY Tac CTT GTT ACG ACT T-3′) blev anvendt til amplifikation, og derefter blev der udført 35 amplifikationscykler ved 94 C i 45 sek, 55 C i 60 sek og 72 C i 60 sek. ikke-inkorporerede PCR-primere og dNTPs blev fjernet fra PCR-produkter ved Montage PCR Clean Up kit (Millipore). 1.400 bp blev sekventeret af 518f / 800R primere (518f: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800r: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Sekventering blev udført ved hjælp af Big Dye terminator cycle sekventering kit v. 3.1 (Applied BioSystems, USA). Sekventeringsprodukter blev løst på et Applied Biosystems model 3730hl automatiseret DNA-sekventeringssystem (Applied BioSystems, USA) hos Macrogen, Inc., Seoul, Korea.

sekvenserne blev analyseret og sammenlignet med den offentlige nukleotiddatabase ved hjælp af NCBI BLAST hjemmeside (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Sekvenser af de nærmeste slægtninge blev derefter hentet fra databasen og brugt til at konstruere et fylogenetisk træ ved hjælp af MEGA5 (Tamura et al., 2011). GC-indhold sekvenserne blev beregnet af Oligo Calculator (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

resultater

fysisk-kemiske egenskaber af prøverne: Døde Hav vandprøver var meget saltvand spænder fra (36-38%). Prøvernes pH-værdier var lave og varierede fra 5,6 til 6,3. Dette indikerer den lidt sure egenskab af havvand. BOD-værdien var meget lav (1-2 mg O2 L-1), hvilket indikerer meget lavt indhold af organisk materiale i prøven. De fysisk-kemiske egenskaber er vist i tabel 2.

heterotrofisk levedygtig bakterietælling: resultater af levedygtigt pladetælling afslørede meget lavt antal kolonidannende enheder i hver prøve (200-6000 cfu mL-1). CFU-tællingen er vist i flere detaljer i tabel 3.

isolering og klassificering af halofile heterotrofe bakterier: i denne undersøgelse har vi isoleret 44 halofile heterotrofe bakteriestammer. Elleve bakteriestammer ud af 44 blev betragtet som forskellige baseret på kolonimorfologi, gramfarvning og cellemorfologi. Syv ud af elleve forskellige stammer var Gram-positive og 4 ud af 7 var Gram-negative. Bakteriestammerne blev identificeret baseret på 16S rRNA-genanalyse, og de viste sig at tilhøre bakteriens domæne. Den nærmeste slægtning til hver isoleret bakteriestamme er vist i tabel 4 og Fig. 2. Alle sekvenser viste et relativt højt GC-indhold (op til 58%).

diskussion

de fysisk-kemiske egenskaber ved døde havvandsprøver blev bestemt og analyseret. Saltholdighedsprocenten viste sig at være meget høj (op til 38%). Dette er et typisk kendetegn ved Dødehavsvand, hvilket gør det til en af de berømte “athalassohaline” saltvand (Oren, 2007). PH i dødehavsvand viste sig at være let surt (5,6-6,3) sammenlignet med pH (7,5-8) i thalassohalin-saltvand (Oren, 2007). Bod af prøverne var meget lav (1-2 mg O2 L-1) afspejler lavt organisk materiale i vand, der kunne udnyttes af heterotrofe bakterier. Disse fysisk-kemiske forhold påvirker utvivlsomt den mikrobielle mangfoldighed negativt. Derfor var antallet af levedygtige celler i de testede prøver meget lavt (højst 6h102 cfu mL-1) sammenlignet med åbent havvand. Tællinger af heterotrofe bakterier i havvand er normalt i størrelsesordenen 105 til 106 bakterier mL-1 (Tvifel og Hagstrom, 1995; Madigan og Martinko, 2006). Disse tal er afledt af uspecifikke fluorescerende farvningsteknikker (1995), som normalt giver højere tal end levedygtig pladetællingsmetode. De første publikationer om bakterietælling i Dødehavet blev udført ved mikroskopi. Antallet af celler var ca. 1.9h106 celler mL1 og under blomstring af røde halobakterier befolkningstætheder nåede 1, 9h107, men faldt efter møl til 5h106 (Oren, 1983).

forskning på halofile organismer, der befinder sig i Det Døde Hav, startede meget tidligt i 1892, da bakterier blev isoleret fra slægten Clostridium fra mudder (Oren, 2002). Senere, i en kort artikel offentliggjort i 1936, gav den første beskrivelse af et oprindeligt mikrobielt samfund tilpasset de ekstremt barske forhold i Det Døde Hav (Oren og Ventosa, 1999). Siden da er vores viden om de biologiske aspekter af Det Døde Hav udvidet og akkumuleret. Vi gennemførte denne forskning for at udvide vores viden om de halofile heterotrofe bakterier, der trives i kystområdet i det jordanske Døde Hav. Vi har isoleret forskellige bakteriearter. Derefter isolerede og identificerede vi 11 forskellige arter af halofile bakterier. De fleste isolater var Gram-positive (7 ud af 11). Selvom grampositive bakterier besidder vigtige tilpasninger, gør det muligt for dem at kup med miljøbelastning som høj saltholdighed (2009). Det er ikke klart i litteraturen, om Gram-positive bakterier eller Gram-negative bakterier er dominerende i hypersalinmiljøer. I en undersøgelse af prokaryote halofiler genvundet fra sedimenter fra den lavvandede el-Djerid salt lake i Tunesien, Hedi et al. (2009) fandt ud af, at den dominerende bakteriepopulation tilhører Gram-positive sporedannende bakterier.

alle de isolerede stammer i denne undersøgelse tilhører bakteriens domæne. De tilhører 7 forskellige slægter i domænet. Fem ud af syv Gram-positive bakterieisolater tilhører slægten Bacillus. Denne slægt blev etableret i 1872 for at omfatte tre arter, men nu er der 142 navngivne Bacillus-arter opført i Bergeys Manual for systematisk bakteriologi (Logan og de Vos, 2009). Bacillus stammer er typisk jord stammer. Bacillus stammer isoleret i denne undersøgelse tilhører følgende arter B. licheniformis, B. pumilus, B. hvajinpoensis og B. cereus. Disse stammer blev stødt på i forskellige salte miljøer (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Yoon et al., 2004; Al-al., 2011). For eksempel B. licheniformis blev tidligere genvundet fra marine sedimenter af Miranda et al. (2008), mens B. pumilus blev isoleret fra marine organismer som østers, krabber og fisk ud over sedimenter af Parvathi et al. (2009). B. hvajinpoensis blev udvundet fra havvand i Østhavet og Det Gule Hav i Korea (Yoon et al., 2004). Og endelig B. cereus, en almindelig jordbakterie, blev fundet i spildevand, men med halofile egenskaber., 2011). Tyk cellevæg, højt peptidoglycanindhold (mere end 90% af cellevæggen) (Madigan og Martinko, 2006), højt GC-indhold og resistent sporedannelse er hovedårsagerne til bacillusoverlevelse under barske forhold som høj saltholdighed. Det skal bemærkes, at stamme DSD32 (identificeret som B. cereus) har den meget lave lighed med dens nærmeste relative B. cereus. Denne stamme kan repræsentere en ny art i slægten Bacillus baseret på 16S rRNA gen.

de to andre Gram-positive bakterier er stammer af Arthrobacter sp. og Kocuria rosea. Arthrobacter arter er bredt fordelt i naturen, især i jord (Funke et al., 1996), men er ikke særlig almindelig i hypersalinmiljøer. Kocuria rosea betragtes som moderat halofile arter, og den blev genvundet fra forskellige saltvandsmiljøer som saltvand åbent lavt vand, og nogle stammer af Kocuria rosea vokser optimalt ved NaCl-koncentration på 30% (Tanaka, 2002).

gramnegative bakterier var mindre hyppige i vores prøver (4 ud af 11). Ikke desto mindre viser offentliggjort litteratur, at disse isolater ikke er ualmindelige i salte miljøer. En af de isolerede stammer blev identificeret som Vibrio alginolyticus. Sidstnævnte art er faktisk almindelig i marine prøver (Molitoris et al., 1985) og blev fundet i marine havvand. Stammen har medicinsk betydning, fordi den kan forårsage kompliceret hud-og bløddelsinfektion (Sganga et al., 2009). Endnu vigtigere blev nogle stammer af Vibrio alginolyticus fundet at producere tetrodotoksin, et stærkt neurotoksin (Noguchi et al., 1987). En anden Gram-negativ bakterie identificeret i denne undersøgelse er Chromohalobacter saleksigens. Denne art blev først isoleret og beskrevet som den moderat halofile Art Halomonas elongata og derefter foreslået som nye arter af Chromohalobacter (Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli er en anden art identificeret i denne undersøgelse. Denne stamme er heller ikke ualmindeligt for saltvandshabitater. Det blev for nylig isoleret fra tidevandsflade i Det Gule Hav i Korea, og det blev beskrevet som halofile arter af Yoon et al. (2005). Den sidste stamme tilhører Salinivibrio costicola. Denne art blev først beskrevet som vibrio costicola, men dens fænotypiske og genotypiske egenskaber adskiller den fra arter af slægten vibrio. Derfor blev stammen anbragt i en ny separat slægt ved navn Salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola er moderat halofil og blev oprindeligt isoleret fra saltet mad og vokser optimalt i medier indeholdende 10% salte (Mellado et al., 1996). Et medlem af slægten Salinibacter, S. ruber, er en interessant model til undersøgelse af tilpasningen af mikroorganismer til livet ved høje saltkoncentrationer (Oren, 2007).

konklusion

dødt havvand fra kystområdet er kendetegnet ved høj saltholdighed, lav pH, lavt indhold af organisk materiale (lavt BOD) og begrænser forskellige arter af heterotrofe bakterier, der tilhører både Gram-positive og Gram-negative slægter, herunder Arthrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus og Erythrobacter.

anerkendelse

denne undersøgelse blev støttet af dekanship of academic research ved Al al-Bayt University, Jordan, afgørelse truffet af det videnskabelige Forskningsråd i møde nummer 2/2010/2011. Således vil forfatteren gerne sætte pris på den økonomiske bistand fra universitetet.