grundlæggende og translationel urologi

eksperimentel model af human corpus cavernosum glat muskelafslapning

Rommel P. RegadasI; Maria E. A. MoraesII; Francisco J. C. Maskitai; Joao B. G. Cerceirai; Lucio F. Gonsaga-SilvaI

Idepartment of Surgery, School of Medicine, Federal University of Ceara, Ceara, Brasilien
iidepartment of pharmacology, School of Medicine, Federal University of Ceara, Ceara, Brasilien

korrespondance

abstrakt

formål: At beskrive en teknik til en bloc høst af corpus cavernosum, cavernous arterie og urinrør fra transplantationsorgan donorer og sammentrækning-afslapning eksperimenter med corpus cavernosum glat muskel.
materialer og metoder: corpus cavernosum blev dissekeret til fastgørelsespunktet med crus-penis. Et segment på 3 cm (corpus cavernosum og urinrør) blev isoleret og anbragt i iskold steril transportbuffer. Under forstørrelse blev den kavernøse arterie dissekeret. Således blev der opnået 2 cm fragmenter af cavernous arterie og corpus cavernosum. Strimler, der måler 3 * 3 * 8 mm3, blev derefter monteret lodret i en isoleret organbadindretning. Sammentrækninger blev målt isometrisk med en narko-Biosystems kraftforskydningstransducer (model F-60, narko-Biosystems, Houston, USA) og registreret på en 4-kanals narko-Biosystems desk model polygraph.
resultater: phenylephrin (1 liter) blev brugt til at inducere toniske sammentrækninger i corpus cavernosum (3 – 5 g spænding) og kavernøs arterie (0,5 – 1 g spænding), indtil de nåede et plateau. Efter prækontraktion blev glatte muskelafslappende midler brugt til at producere afslapningsresponskurver (10-12m til 10-4 M). Natriumnitroprussid blev brugt som afslapningskontrol.
konklusion: høstteknikken og den glatte muskelkontraktions-afslapningsmodel beskrevet i denne undersøgelse viste sig at være nyttige instrumenter i søgen efter nye lægemidler til behandling af human erektil dysfunktion.

nøgleord: penis; kavernøs arterie; erektion af penis; eksperimentel; erektil dysfunktion

introduktion

erektil dysfunktion (ED) påvirker cirka 150 millioner mennesker over hele verden. Forekomsten af ED i Brasilien er høj: mere end 40% af brasilianske mænd mellem 40 og 70 år lider af ED, og mere end en million nye sager registreres årligt 1,2.

selvom phosphodiesterase type-5 (PDE-5) hæmmere har revolutioneret behandlingen af erektil dysfunktion, drager mange patienter, for det meste dem med endotel dysfunktion (56% af tilfældene), ikke fordel af denne form for terapi 3.

i øjeblikket udføres mange undersøgelser ved hjælp af donorer af salpetersyre (NO), guanylylcyclaseaktivatorer (både opløselige intracellulære og membranbundne isoformer), ionkanalagonister og RhoA-kinasehæmmere for at formulere nye lægemidler med forskellige virkningsmekanismer til behandling af denne patientpopulation 4,5.

langt de fleste af disse undersøgelser anvender rotte-og kaninkorpus cavernosum på grund af vanskelighederne med at få prøver af humant væv 5-7. På vores Urologitjeneste har eksperimentelle undersøgelser af ED imidlertid været i gang siden 2004 ved hjælp af humant corpus cavernosumvæv fra organdonorer.

formålet med denne undersøgelse var at give en detaljeret beskrivelse af den teknik, der blev brugt til en bloc høst af corpus cavernosum, cavernous arterie og urinrør hos transplantationsorgandonorer og de metoder, der blev anvendt i sammentrækning-afslapningseksperimenter med corpus cavernosum glat muskel.

materialer og metoder

alle studieprotokoller blev tidligere godkendt af Human Subjects Research Ethics Committee ved Federal University of Cear Karrus og af National Research Ethics Committee fra det brasilianske sundhedsministerium.

efter tilladelse fra familien blev humant corpus cavernosum opnået fra kadaverdonorer (< 40 år) under operation for organtransplantation.

efter fjernelse af hjerte, lever og nyrer og gennem det samme snit (formet pubic) var corpus cavernosum placeret over pubic symphysis ved digital hypodermisk tilgang. Corpus cavernosum blev dissekeret til fastgørelsespunktet med den ischiopubiske ramus (crus penis) (Figur-1).

et 3 cm segment inklusive corpus cavernosum og urinrør blev isoleret en blok (figur-2). Der blev ikke foretaget yderligere eksternt snit ved afslutningen af proceduren. Derefter blev vævene anbragt i iskold steril transportbuffer (Collins-opløsning) og behandlet inden for 1 time efter opsamling.

prøverne blev behandlet under stereoskopisk forstørrelse. Hele den kavernøse arterie i midten af corpus cavernosum blev dissekeret og isoleret fra de omgivende kavernøse væv (figur-3). Derefter blev kavernøse væv adskilt fra bindevæv og tunica albuginea. Således blev der opnået 2 cm fragmenter af hver kavernøs arterie og corpus cavernosum.

corpus cavernosum-fragmenterne blev skåret i strimler, der måler cirka 3 gange 3 gange 8 mm3 og monteret lodret under 1 g hvilepænding. Den kavernøse arterie blev skåret i 5 mm ringe og monteret vandret under 0,2 g hvilepænding. Vævene blev opretholdt i 5 mL organkamre indeholdende Krebs-Henseleit-medium sammensat af 114,6 mM NaCl, 4,96 mM KCl, 1,3 mM MgSO4, 2,0 mM CaCl2, 1,23 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3 og 3,6 mM glucose, beriget med 10 liter guanethidin og 10 liter indomethacin (pH 7,4, 37 liter, Gasset med 5% CO2 og 95% O2).

vævene fik lov til at ækvilibrere i 90 minutter med vask med 15 min intervaller. Spændingen blev målt ved hjælp af en isometrisk transducer (F-60 narko-biosystemer forbundet til en 4-kanals skrivebordsmodel polygraf) (figur-4).

en mikromolphenylephrin blev tilsat til badene for at opnå 60-70% submaksimale glatte muskelkontraktioner. Derefter blev koncentrationsresponskurver (10-8 m til 10-2 M) til glatmuskelafslappende midler eller natriumnitroprussid (SNP), en salpetersyre donor, plottet for at kontrollere for endotel funktionel integritet.

resultater

phenylephrin (1 liter) blev brugt til at inducere toniske sammentrækninger i corpus cavernosum (3-5 g spænding) og cavernøs arterie (0,5 – 1 g spænding), indtil de nåede et plateau. Efter prækontraktion blev glatte muskelafslappende midler brugt til at producere afslapningsresponskurver (10-12m til 10-4 M). SNP blev brugt som afslapningskontrol.

en række kemiske stoffer er blevet brugt i vores laboratorium til at inducere glat muskelafslapning, herunder RuC13, en salpetersyre donor. Det slapper fuldstændigt af det menneskelige corpus cavernosum og den kavernøse arterie, der opnår en Emakse på 100% og en EC50 på 6,4 liter 0,14 (figur-5).

brug af præparater af corpus cavernosum med intakt endotel fra humane donorer under 40 år uden historie med erektil dysfunktion eller kardiovaskulære risikofaktorer (f.eks. diabetes, hypertension og dyslipidemier), denne fysio-farmakologiske model viste sig at være et attraktivt instrument i søgningen efter nye lægemidler til behandling af human erektil dysfunktion.

PDE-5-hæmmere har revolutioneret behandlingen af erektil dysfunktion. Imidlertid lider mange patienter med ED også af endotel dysfunktion (56%) og reagerer derfor ikke på denne klasse af lægemidler 3.

endotel dysfunktion observeres ofte hos patienter med comorbiditeter såsom arteriel hypertension og diabetes mellitus. Det er kendetegnet ved en mangel i den endogene produktion af NO 8.

i ægte ED har diabetes, hypertension og dyslipidæmi (komponenter i det metaboliske syndrom) tendens til at være forbundet med endotel dysfunktion. ED er også rapporteret at være en markør for kardiovaskulær arteriel sygdom 9.

søgningen efter nye lægemidler, der er i stand til at øge tilgængeligheden af endogent NO, har været en betydelig udfordring. Flere eksperimentelle modeller er blevet brugt i løbet af de sidste årtier baseret på Rotte, Kanin og humant corpus cavernosum 6,7,10,11.ved hjælp af corpus cavernosum in vivo og andre væv (f.eks. blodplader) fra arter som rotter, kaniner og mennesker. 12 konkluderede, at på trods af lignende kinetik og træk har forskellige PDE ‘ er forskellige følsomheder over for inhibitorer. Dette skal tages i betragtning ved arbejde med eksperimentelle modeller af denne type.

vores eksperimentelle model anvendte sunde corpus cavernosumvæv fra unge kadaverdonorer dræbt af traumer eller slagtilfælde for at minimere bekymringen for forvrængning af resultater forårsaget af prøvevæv med dårlig tilstand.i modsætning hertil blev der i en undersøgelse, der anvendte en lignende human corpus cavernosum-model til evaluering af effekten af sildenafil på hæmning af PDE og deraf følgende glat muskelafslapning, opnået prøver fra patienter med ED under operation til implantation af penisproteser, så det forekommer sandsynligt, at i dette tilfælde præsenterede de fleste af forsøgspersonerne endotelskade til en vis grad 6.

en anden bekymring inden for dette forskningsområde er tilgængeligheden af væv til at udføre eksperimenterne. I Cear Krist udføres otte organtransplantationer hver måned, hvilket gør det muligt at gennemføre undersøgelser uden større afbrydelser.

Seidler et al. 4 arbejdede på en lignende model ved hjælp af corpus cavernosum doneret af patienter, der gennemgår kønsfordelingskirurgi som behandling for transseksualisme og kønsidentitetsforstyrrelse. På trods af vævets gode tilstand begrænser det lille antal mænd, der underkaster sig denne type procedure, muligheden for at samle tilstrækkeligt væv til eksperimentelt arbejde.

dette papir præsenterer en omfattende model til høst af humane corpus cavernosumvæv og til udførelse af eksperimenter med glat muskelafslapning in vivo. Sundt humant corpus cavernosum fjernes fra kadaverdonorer og udsættes for forsøg i isolerede bade. Teknikken gør det muligt at dissekere og isolere corpus cavernosum, cavernous arterie og urinrør.

betydningen af teknikken ligger i, at den gør det muligt at teste en række nye lægemidler, herunder stabile no-donorer, guanylylcyclaseaktivatorer og RhoA-kinasehæmmere, på glat muskel corpus cavernosum, penisarterier og urinrør 7,12-15.

konklusion

denne eksperimentelle model involverer dissektion, høst, isolering og bevarelse af det humane corpus cavernosum, kavernøs arterie og urinrør under ideelle forhold sammen med de ledsagende fysio-farmakologiske undersøgelser. Muligheden og reproducerbarheden af modellen gør det til et attraktivt instrument i søgen efter nye lægemidler til behandling af human erektil dysfunktion.

interessekonflikt

ingen erklæret.

1. Moreira ED Jr, Bartolo EB, Fittipaldi JA: prævalens og determinanter for erektil dysfunktion i Santos, sydøstlige Brasilien. Sao Paulo Med J. 2002; 120: 49-54.

2. Moreira ED Jr, Lisboa L Larsbo CF, Villa M, Nicolosi A, Glasser DB: prævalens og korrelater af erektil dysfunktion i Salvador, nordøstlige Brasilien: en befolkningsbaseret undersøgelse. Int J Impot Res. 2002; 14 (Suppl 2): S3-9.

3. Feldman HA, Goldstein I, Hattristou DG, Krane RJ, McKinlay JB: impotens og dets medicinske og psykosociale korrelater: resultater af Massachusetts Male Aging Study. J Urol. 1994; 151: 54-61.

4. Seidler M, Uckert S, Valdkirch E, Stief CG, Oelke M, Tsikas D, et al.: In vitro virkninger af en ny klasse af salpetersyre (NO), der donerer forbindelser på isoleret humant erektilvæv. Eur Urol. 2002; 42: 523-8.

5. Lopes LFG, El-Sherif, Clarke MJ: D-translabilisering af salpetersyre i Ru-II-komplekser med C-bundne Imidaser. Inorg-Chim Acta 2001; 312: 15-22.

6. Ballard SA, Gingell CJ, Tang K, Turner LA, Price ME, Naylor AM: virkninger af sildenafil på afslapning af humant corpus cavernosumvæv in vitro og på aktiviteterne af cykliske nukleotidphosphodiesteraseisosymer. J Urol. 1998; 159: 2164-71.

7. Prieto D, Rivera L, Recio P, Rubio JL, hernia M, Garca-Sacristherristn a: rolle af salpetersyre i afslapningen fremkaldt af sildenafil i penisresistensarterier. J Urol. 2006; 175: 1164-70.

8. Rendell MS, Rajfer J, Flet PA, Smith MD: Sildenafil til behandling af erektil dysfunktion hos mænd med diabetes: et randomiseret kontrolleret forsøg. Sildenafil Diabetes Studiegruppe. JAMA. 1999; 281: 421-6.

9. Palumbo PJ: metaboliske risikofaktorer, endotel dysfunktion og erektil dysfunktion hos mænd med diabetes. Er J Med Sci. 2007; 334: 466-80.

10. Thompson CS, Mor, Khan MA, Mikhailidis DP, Morgan RJ, et al.: Effekten af sildenafil på corpus cavernosal glat muskelafslapning og cyklisk GMP-dannelse i diabetisk kanin. EUR J Pharmacol. 2001; 425: 57-64.

11. Angulo J, Cuevas P, Moncada I, Martinus-Morales A, Allona a, bregne, et al.: Begrundelse for kombinationen af PGE (1) og S-nitroso-glutathion for at inducere afslapning af menneskelig penis glat muskel. J Pharmacol Eksp Ther. 2000; 295: 586-93.

12. Vang P, Vu P, Myers JG, Stamford a, Egan RV, Billah MM: karakterisering af mennesker, hund og kanin corpus cavernosum type 5 fosfodiesteraser. Livet Sci. 2001; 68: 1977-87.

13. Det er en af de mest almindelige typer af histamin, der findes i den menneskelige krop. J Cardiovasc Pharmacol. 2000; 36: 737-43.

14. Matsumoto A, Morita T, Kondo s: alfa-adrenoceptor-medieret penis erektion hos hunde: in vivo og in vitro observationer. J Glat Muskel Res. 2000; 36: 169-79.

15. Andersson KE, Gratske C: farmakologi af alfa1-adrenoceptorantagonister i de nedre urinveje og centralnervesystemet. Nat Clin Pract Urol. 2007; 4: 368-78.

korrespondance til
Dr. Rommel Prata Regadas
Dr. Ratisbona, 208, Fatima
Fortalesa, Cear Larsen, 60411-220, Brasilien
Faks: + 55 85 3366-8064
E-mail: [email protected]

accepteret efter revision: 20. januar 2010

redaktionel kommentar

penile erektion er en kompleks neurovaskulær begivenhed, der er afhængig af vasodilatation af erektilvæv på grund af neuronal og endotelafledt salpetersyre (NO) frigivet ved aktivering af parasympatiske nerver ved seksuel stimulering af den kavernøse endotelforing 1.

denne seksuelle stimulus medfører blodgennemstrømning i corpus cavernosum, og den deraf følgende stivhed i penis opretholdes ved hjælp af en veno-okklusiv mekanisme.

Dette er aktiveret af den særlige mikroarkitektur af corpus cavernosum, som giver samtykke til et sofistikeret hæmodynamisk system.

ellers spiller tunica albuginea en nøglerolle i erektilfunktionen.

da den er rig på elastiske fibre, er den i stand til at modstå overstrækning af corpus ved hævede niveauer af intracavernøst tryk, komprimere de trans-albugineale udløbsårer samt tilvejebringe på uudvidelig beskyttelsesstruktur til arteriolen og til de intracavernøse nerver.

denne funktion er mulig på grund af dens struktur lavet af kollagenfibre forbundet med elastiske fiberbroer 2,3

derfor er det meget vigtigt at bevare sin integritet for at opretholde sin grundlæggende rolle i erektilmekanismen.

tilstedeværelsen af strukturelle lidelser som en overdreven kollagenaflejring giver anledning til dannelsen af en plak, fibrotisk først og derefter forkalket, som det kan findes i Peyronies sygdom.

desuden er der også et signifikant fald i elastisk fiberkoncentration hos disse patienter, der er ramt af induration penis plastica 4.

lignende ændringer blev fundet hos patienter, der gennemgik radikal prostatektomi, hvor de trabekulære elastiske fibre og glatte muskelfibre blev nedsat, og kollagenindholdet blev signifikant øget 5.

efterhånden som alderen skrider frem gonadale steroidhormoner, og især testosteronproduktionen falder 6, nerveledningen sænkes, og effektiviteten af den vaskulære mikrocirkulation af penis reduceres.

androgener er afgørende for udvikling, vækst og modning af erektilvæv, der virker på hæmostatisen i corpora cavernosum, der regulerer væksten af glat muskel og proteinsyntese af bindevævet.

derfor kan et fald i deres produktion give anledning til skiftet fra elastiske fibre til kollagenfibre, som er grundlaget for cavernosal fibrose 7,8.

nylige undersøgelser har vist, at testosteron også regulerer ekspressionen af phosphodiesterasis type 5 (PDE5) 9.

det er kendt, at erektil dysfunktion (ED) påvirker 150 millioner mennesker over hele verden.

indtil for få år siden blev det antaget, at 90% af ED havde en psykogenetisk ætiologi.

desuden har yderligere neurofysiologiske, hæmodynamiske og farmakologiske undersøgelser hjulpet os med at forstå bedre den komplekse biokemiske og mikroanatomiske mekanisme for erektilfunktionen, hvilket viser os, at 50% af ED har en organisk etiologi 10.

på den anden side kan selv psykogenetisk ED være konsekvensen af en stigning i adrenerg stimulering og have sig selv en organisk oprindelse 11.

de sidste 20 år har været vidne til bemærkelsesværdige ændringer i behandlingen af ED.

fremkomsten og succesen af PDE5-hæmmere som effektiv terapi til erektil dysfunktion er bemærkelsesværdig i betragtning af hensigten bag udviklingen af den oprindelige forbindelse: oprindeligt designet som et antianginal middel blev det hurtigt klart, at den første PDE5-hæmmer på markedet, sildenafil, viste erectogenese som en bivirkning, og lægemidlet blev snart anerkendt som en potentiel revolutionerende behandling for ED.

desuden har sildenafil vist sig at forhindre progression af fibrose af corpus cavernosum hos prostatektomiserede patienter. Dens effektivitet synes at skyldes en anti-proliferativ virkning udøvet på fibroblaster 12.

det er kendt, at PDE-5-hæmmere har revolutioneret behandlingen af erektil dysfunktion og ændret livet for millioner mennesker over hele verden.

der er dog stadig en høj procentdel af patienter med ED, der også er påvirket af endotel dysfunktion (56%), og efterfølgende reagerer de ikke på denne klasse af lægemidler 13.

selvom det allerede er grundigt undersøgt, er ingen donorer fortsat et vigtigt emne med hensyn til ED.

mange undersøgelser er blevet udført for at finde nye ingen donorer eller nye guanylylcyclaseaktivatorer for at forsøge at finde nye lægemidler til behandling af disse patienter, der ikke er responderende på PDE-5-hæmmere 14.

det nuværende arbejde viser os en model til høst af humane corpus cavernosumvæv og til fremstilling af eksperimenter med glat muskelafslapning in vivo.

det sunde corpus cavernosum taget fra unge kadaverdonorer dræbt af traumer eller slagtilfælde tilbyder væv i god stand.

i litteraturen har vi ikke fundet en lignende tilgang på grund af vanskeligheden med at opnå prøver af humane væv.med denne teknik er det muligt at teste nye lægemidler, som ingen donorer, guanylylcyclaseaktivatorer og RohA-kinasehæmmere på humane glatte muskelvæv in vivo snarere end at bruge corpus cavernosum in vivo fra dyr som rotter eller kaniner, som det er blevet udført af Pen Vang et al. 15.

endelig kan denne høstteknik og glat muskelkontraktion-afslapningsmodel være et meget nyttigt instrument til at hjælpe os med at finde nye lægemidler til behandling af ED.

1. Andersson KE, Vagner G: fysiologi af penis erektion. Physiol Rev. 1995; 75: 191-236.

2. Iacono F, Barra S, De Rosa G, Boscaino a, Lotti t: mikrostrukturelle lidelser i tunica albuginea hos patienter, der er ramt af impotens. Eur Urol. 1994; 26: 233-9.

3. Iacono F, Barra S, Lotti t: elastisk fiberkoncentration i tunica albuginea af corpora cavernosa og natlig tumescensovervågning. Int J Impot Res. 1995; 7: 63-70.

4. Iacono F, Barra S, De Rosa G, Boscaino A, Lotti T: Mikrostrukturelle lidelser i tunica albuginea hos patienter, der er ramt af Peyronies sygdom med eller uden erektionsdysfunktion. J Urol. 1993; 150: 1806-9.

5. Iacono F, Giannella R, Somma P, Manno G, Fusco F, Mirone V: histologiske ændringer i kavernøst væv efter radikal prostatektomi. J Urol. 2005; 173: 1673-6.

6. Traish a, Kim N: androgenernes fysiologiske rolle i erektion af penis: regulering af corpus cavernosum struktur og funktion. J Køn Med. 2005; 2: 759-70.

7. Traish AM, Guay AT: er androgener kritiske for penile erektioner hos mennesker? Undersøgelse af kliniske og prækliniske beviser. J Køn Med. 2006; 3: 382-404; diskussion 404-7.

8. Park K, Seo JJ, Kang HK, Ryu SB, Kim HJ, Jeong GV: et nyt potentiale for iltningsniveauafhængig (fed) funktionel MR til evaluering af cerebrale centre for erektion af penis. Int J Impot Res. 2001; 13: 73-81.

9. Morelli A, Filippi S, Mancina R, Luconi M, Marini M, Et Al. Androgener regulerer phosphodiesterase type 5 ekspression og funktionel aktivitet i corpora cavernosa. Endokrinologi. 2004; 145: 2253-63. Erratum i: endokrinologi. 2004; 145: 3152.

10. Kaiser FE: erektil dysfunktion hos den aldrende mand. Med Clin North Am. 1999; 83: 1267-78.

11. Iacono F, Barra s, Lotti t: evaluering af penile dybe arterier i psykogen impotens ved hjælp af dupleks ultrasonografi. J Urol. 1993; 149: 1262-4.

12. Iacono F, Presioso D, Somma P, Chierchia S, Galasso R, Micheli P: histopatologisk bevist forebyggelse af post-prostatektomi cavernosal fibrose med sildenafil. Urol Int. 2008; 80: 249-52.

13. Feldman HA, Goldstein I, Hattristou GD, Krane RJ, McKinlay JB: impotens og dets medicinske og psykosociale korrelater: resultater af Massachusetts Male Aging Study. J Urol. 1994; 151: 54-61.

14. Seidler M, Uckert S, Valdkirch E, Stief CG, Oelke M, Tsikas D, et al.: In vitro virkninger af en ny klasse af salpetersyre (NO), der donerer forbindelser på isoleret humant erektilvæv. Eur Urol. 2002; 42: 523-8.

15. Vang P, Vu P, Myers JG, Stamford a, Egan RV, Billah MM: karakterisering af mennesker, hund og kanin corpus cavernosum type 5 fosfodiesteraser. Livet Sci. 2001; 68: 1977-87.