eksperimentelt design og undersøgelsessystem

i 2012 blev 300 frø af hurtige cykelbrassica rapa-planter (fast Plants standard Seed, med høj genetisk variation) opnået fra Carolina biologiske forsyninger og dyrket i en phytotron under standardiserede jord -, lys-og vandingsforhold. Disse planter er fuldt udkrydsende (selvkompatible) og har nok stående genetisk variation til let at reagere på selection58,59. Fra disse 300 planter blev 108 fulde sib-frøfamilier genereret af kunstige krydsninger (kun frøfamilier fra kryds, hvor begge forældre producerede frugter, blev brugt). Disse 108 fulde SIB-frøfamilier blev brugt som startpopulation til eksperimentet.

for den første generation af eksperimentet blev der oprettet tre behandlingsgrupper ved hjælp af de 108 familier, så hver familie var repræsenteret i hver behandling for at kontrollere for genotype blandt behandlinger (supplerende Fig. 1). Hver behandling bestod derfor af 108 planter (der repræsenterer 108 frøfamilier), som vi opdelte i tre replikater (A,B,C), der hver indeholdt 36 planter. Replikaterne inden for behandlingerne blev holdt som isolerede linjer i løbet af 9 generationer (ingen kryds mellem replikater blev udført) for at kunne vurdere uafhængige, gentagelige evolutionære ændringer. Planterne af alle replikater i alle behandlingerne blev dyrket i phytotronen under standardiseret jord (Einheitserde classic), lys (24 h lys) og vandingsforhold. Alle planter blev fænotypet hver anden generation startende med generation 1. Blomsterduftdata fra generationer 1 og 3 gik tabt på grund af tekniske problemer; i stedet blev duft indsamlet fra generation 4. Blomsterduftdata fra generation 1 blev opnået efter afslutningen af eksperimentet ved at dyrke planter fra startgenerationen og samle duft fra en plante fra hver af de 108 frøfamilier. Således blev der fra første generation i alt 108 planter (36 Fra hver replikat) udtaget til blomsterduft på samme tid som planter i generation 9.

eksperimentel evolution og bestøvningsbehandlinger

i vores undersøgelse brugte vi tre bestøvningsbehandlinger: humlebier (‘BB’, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Sverige), svævefly (‘Hf’, Episyrphus balteatus, biotek AG, Tyskland) og håndbestøvning. Begge insekter besøger let blomster af mange Brassicaceae-arter i naturen, men repræsenterer forskellige funktionelle bestøvningskategorier og har vist sig at variere i overflod i naturlige habitats46. Anvendelsen af enkeltbestøverarter efterligner pollineringsmiljøer, hvor de mest rigelige pollinatorer er funktionelt forskellige. I kontrolbehandlingen (‘CO’) blev tilfældigt udvalgte planter krydsbestøvet manuelt.

bestøvning blev udført 23 dage efter såning i et flyvebur (2,5 m liter 1,8 m liter 1,2 m) i drivhuset under standardiserede lysforhold med humle og svævefly. Eksperimenter blev udført mellem 0900 timer og 1.500 timer. Humlebier blev holdt i et separat flybur i drivhuset. Hoverflies blev købt som pupper og opdrættet indtil udklækning, hvorefter mandlige og kvindelige fluer blev adskilt. Bestøvere fik lov til at fodre på hurtig cykling B. rapa-planter (planter fra kontrolgruppen i den respektive generation) og fodret med yderligere pollen indtil 3 dage før bestøvningsbehandlingen; bagefter blev der kun leveret pollen og sukkeropløsning; 16 timer. før bestøvning blev bestøvere sultet.

til bestøvning blev alle planter af en replikat tilfældigt placeret i en firkant på 6 liter 6 planter med en afstand på 20 cm fra hinanden i flyveburet. Fem bestøvere blev tilsat individuelt og sekventielt, og hvert insekt fik lov til at besøge maksimalt tre forskellige planter og derefter fjernet fra buret; hvert insekt blev kun brugt en gang. I alt modtog 12-15 planter pr. Det samlede gennemsnitlige antal besøg (i besøgte planter) var 1,35 liter 0,63 for humlebi-bestøvede planter og 1,28 liter 0,53 for hoverfly-bestøvede planter. For de planter, der blev besøgt, blev antallet af besøg og antallet af besøgte blomster registreret. I kontrolgruppen, 12 planter blev valgt tilfældigt pr. replikat, og 5 blomster af hver plante blev håndbestøvet af en tilfældigt valgt farplante; fædre blev valgt blandt de samme 12 planter. Hver plante kunne være pollendonor til mere end en plante, men modtog kun pollen fra en plante. Efter bestøvning blev besøgte blomster markeret, og planter blev opbevaret i et bur i yderligere 30 dage, indtil frugterne blev samlet. Frø blev talt, og det relative frøsæt blev beregnet for hver plante ved at dividere det individuelle frø, der blev sat med det gennemsnitlige frø, der blev sat i replikatet. Derudover blev antallet af frø pr. frugt beregnet for hver besøgt plante. For hver plante blev mandlig egnethed estimeret som forudsagt faderskab (antal polleneksportbegivenheder).

fra alle frø produceret af de bestøvede blomster blev en delmængde frø, der var repræsentativ for hver enkelt frøproduktion, brugt til at vokse den næste generation. Jo flere frø en plante producerede, jo flere frø bidrog den til den næste generation, som igen bestod af 36 planter for hver replikat. Frøbidraget fra hver besøgt plante til den næste generation blev beregnet for hver replikat som: 36 / (replikere summen af frø / individuelle frø sæt). Værdier under 0,5 blev afrundet op til 1.

indavlsdepression

indavlsdepression under hele eksperimentet blev kvantificeret ved måling af frøvægt og spirehastighed, sidstnævnte som procentdel af frø spiret pr.replikat. For at kontrollere for træk-ændringer som følge af indavl, depression, frø er produceret af planter i 9. generation var vokset (svarende til 10-generation) og manuelt krydset mellem replikater inden for de behandlinger, således at planter af hver enkelt replikat blev pollen donor og modtager pollen for planterne af to forskellige replikater (♀A-♂C, ♀B-♂En, ♀C-♂B). Krydsninger inden for disse kombinationer af replikater var tilfældige. Af de resulterende frø (den ellevte generation) blev der dyrket et individ pr.frøfamilie (36 planter pr. Af disse interreplikatovergange blev træk igen målt og brugt til den endelige sammenligning af træk mellem behandlingsgrupper.

plantegenskaber

de fleste træk, inklusive blomsterduft, blev målt før bestøvning, 19-21 dage efter udsåning. Kronbladets bredde, længde,pistillængde og blomsterdiameter på tre tilfældigt valgte blomster pr. Nektar fra tre blomster blev opsamlet med 1 mikrokapillarrør (blaubrand, Vartheim, Tyskland) og volumenet bestemt ved at måle længden af nektarkolonnen i mikropipetten med en tykkelse. Til kvantificering blev gennemsnittet af tre blomster brugt. For 157 planter jævnt fordelt på tværs af behandlingerne blev sukkerindholdet i nektar bestemt ved hjælp af derivatisering og gaskromatografisk analyse. For at gøre dette blev nektar overført til filterpapir opbevaret i silicagel. Sektoren på filterpapiret, der indeholdt nektar, blev skåret ud af resten af filterpapiret, og nektar blev elueret i 1 ml vand med høj renhed ved at ryste fortyndingen i 90 minutter med 400 r.p.m. ved 60 liter C på en laboratorierystemaskine. Derefter blev 50 liter af opløsningen tørret ved 60 liter C og derivatiseret med 100 liter af en blanding af vandfri pyridin (Fisher Scientific, Geel, Belgien), geksamethylsilasan (Sigma-Aldrich, Buchs, Sverige) og trimethylchlorosilan (Sigma-Aldrich, Buchs, Sverige) (10:5:3). Efterfølgende blev prøver kørt af GC-MS som beskrevet i ref. 32. Vi beregnede de samlede sukkermængder pr. blomst og blomsterstand som summen af alle forskellige sukkerarter (fruktose, glukose, saccharose og sorbitol). Korrelationen mellem nektarsukkerindhold og nektarvolumen var positiv og høj (r156=0,732, P<0,001), således for de resterende planter blev kun nektarvolumen bestemt. Floral scent collection blev udført før bioassays på en ikke-destruktiv måde fra alle planteblomstrer, så snart mindst fem blomster var åbne. Vi brugte headspace sorption med et push-pull system59, 60. Planternes blomsterstande blev lukket i glascylindre, der tidligere var belagt med sigmacote (Sigma-Aldrich) og lukket med en Teflonplade. Antallet af åbne blomster blev talt for hver plante. Luft fra omgivelserne blev skubbet med en strømningshastighed på 100 ml min−1 trug aktiverede kulfiltre ind i glascylinderen. Samtidig blev der trukket luft fra glascylinderen med en strømningshastighed på 150 ml min−1 gennem et glasrør fyldt med 30 mg tenaks TA (60/80 mesh; Supleco, Bellefonte, PA, USA). Luft fra tomme glascylindre blev opsamlet som luftkontrol. Blomsterflygtige stoffer blev opsamlet i to timer i en phytotron under standardiserede lys-og temperaturforhold. Kvantificering af flygtige stoffer blev udført ved gaskromatografi med masseselektiv detektion (GC–MSD). Prøver blev injiceret i en GC (Agilent 6890n; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) af en MultiPurpose Sampler (MPS; Gerstel, m Larrllheim, Tyskland) ved hjælp af en Gerstel termisk desorptionsenhed (TDU; Gerstel) med et koldt injektionssystem (CIS; Gerstel). Til termodesorption blev TDU opvarmet fra 30 til 240 liter C med en hastighed på 60 liter C min−1 og holdt ved en sluttemperatur i 1 minut. CIS blev sat til -150 kr.C under fældningen af eluerende forbindelser fra TDU. Til injektion blev CIS opvarmet til 250 liter C med en hastighed på 12 liter C s−1, og den endelige temperatur blev holdt i 3 minutter. GC var udstyret med en HP-5−søjle (0,25 mm diameter, 0,25 liter filmtykkelse, 15 m længde), og helium blev brugt som bæregas ved en strømningshastighed på 2 ml min-1. Sammensat identifikation og kvantificering blev udført efter60 med Agilent MSD ChemStation-programmet. Kvantificering af forbindelser blev opnået ved måling af spidsområder af udvalgte målioner, der er specifikke for de enkelte duftforbindelser. Specifikke målioner blev opnået ud fra syntetiske standarder for alle forbindelser; spidsområder blev omdannet til absolutte mængder ved anvendelse af kalibreringskurver, der tidligere blev opnået for hver forbindelse ved anvendelse af syntetiske forbindelser i tre forskellige koncentrationer. Kun duftforbindelser, der var til stede i signifikant højere mængder end i luftkontrollen, blev inkluderet i analysen (i alt 14 duftforbindelser). Alle mængder flygtige stoffer blev beregnet i pg pr.blomst L−1 udtaget luft.

treogtyve dage efter såning, samme dag som bestøvning blev udført, blev antallet af åbne blomster og højden af hver plante registreret. Efter bestøvning (men samme dag) blev Farve-reflektansspektre af tre kronblade fra forskellige ikke-pollinerede (når det er muligt) blomster pr. plante registreret ved hjælp af et fiberoptisk spektrofotometer (AvaSpec-2048; Avantes, Apeldoorn, Holland) og en pulserende lyskilde (Avantes, Avantes). Et kronblad ad gangen blev placeret under spektrofotometeret (specifikt med fokus på den distale del af kronbladet), og den procentvise reflektion (i forhold til en hvid standard) mellem 200 og 900 nm hver 0,6 nm blev registreret i transmissionstilstand. Af det målte spektrum blev kun gennemsnittet af reflektionsværdierne hver 10 nm fra 260 til 650 nm fra de tre kronblade anvendt i analysen. I planter af den ellevte generation blev en delmængde af ca 20 planter pr.replikat analyseret for farve, fordi ingen af farve-Pc ‘ erne viste sig at være under udvælgelse under hele eksperimentet. Området med den ultraviolette absorberende og reflekterende kronbladoverflade blev kun målt i anlæg af generation 11 med et ultraviolet følsomt digitalkamera med kvartslinse. Billeder af blomster blev taget og ultraviolet absorberende område kvantificeret ved hjælp af programpakken ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/).

pollinator preference assays

Assays for pollinator præferencer blev udført for hver replikat med begge typer pollinatorer. For hver replikat blev der udført to adfærdsanalyser (en for hver pollinator-behandling). Humlebi-og hoverfly-bestøvede planter (generation 11) af hver replikat blev tilfældigt parret og placeret side om side (ca 30 cm Afstand) i et flybur (2,5 m liter 1,8 m liter 1,2 m). En bestøver blev anbragt i buret og fik lov til at besøge en plante. Pollinatorer blev straks fanget, efter at de havde valgt deres valg. Hvert plantepar blev analyseret med en bestøver.

selvkompatibilitet og autonom selfing

for at teste for selvkompatibilitet voksede vi planter fra den første (15 planter pr.replikat) og den ellevte generation (30 planter pr. replikat). Frøfamilien (fra tilfældigt udvalgte familier) blev dyrket, og to blomster pr. Det gennemsnitlige antal frø produceret pr.selfed blomst for hver enkelt plante blev brugt som en måling af selvkompatibilitet.

for at teste for autonom selfing voksede vi ca 12 planter (et frø pr.familie) pr. replikat fra hver behandling af generation 11 og 1 (i alt 162 planter). Efter 30 dage, hvor ca 20 blomster var åbnet, blev de resterende knopper i hver plante omhyggeligt skåret, og antallet af åbnede blomster blev registreret. Planten fik derefter lov til at udvikle frugter uden insekter, der fik adgang til planterne. Efter modning af frugterne blev frøene opsamlet, og antallet af frø blev talt og vejet for hver plante. Antallet af frugter pr. åben blomst og frø pr. frugt blev brugt som måling til autonom selfing. Åbne blomster, slettede vi disse outliers til den endelige sammenligning af autonom selfing. Følgende antal outliers Blev Udgået: 1 i generation 1; i G11: 2 i BB, 3 I HF, 2 I CO.

statistisk analyse

for at analysere fænotypisk selektion blev selektionsforskelle og gradienter beregnet ved at regressere plantens egnethed til traits61. Denne analyse blev udført separat for behandlingerne, men for alle replikater og generationer kombineret. Som et fitnessestimat blev der anvendt’ antal besøg’, som var en tællevariabel og fulgte en Poisson-fordeling. En anden fitnessvariabel,’ relativ frøsæt ‘ havde en distibution forudindtaget af de mange nulværdier; derudover savnede frøsæt den eneste mandlige fitnesskomponent i den første plante, der blev besøgt, som ikke satte frø fra dette besøg (fordi pollinatorer oprindeligt ikke Bar Brassica pollen). Antallet af besøg var imidlertid stærkt korreleret med relativ frø sæt (BB: r626=0,694, P<0,001; HF: r605=0,597, P<0,001). Generaliserede lineære modeller (med Poisson-distribution) blev brugt til at beregne selektionsgradienter (multivariat) og differentier (univariat) for hver behandling med antal besøg som afhængig variabel og træk som kovariater. Derudover blev kvadratiske selektionsgradienter beregnet med alle træk og den kvadratiske betegnelse for hvert træk tilføjet til modellen og efterfølgende gradienter fordoblet62. For at kontrollere forskelle i udvælgelsen mellem humler og svævefly blev en generaliseret lineær model (med Poisson-fordeling) med antal besøg som afhængig variabel, behandling som fast faktor, planteegenskaber som kovariater og interaktionsbehandling*planteegenskaber blev udført. Før udvælgelsesanalysen blev alle variabler standardiseret til at betyde=0 og s.D.=1 (å-værdier) på replikationsniveauet. En generaliseret lineær model blev også brugt til at sammenligne besøgshastigheder mellem humlebi – og svæveflybestøvede planter på tværs af alle generationer. Floral farve spektrofotometer værdier blev reduceret gennem principal component (PC) analyse med varimaks rotation. Kun pc ‘ er med en egenværdi over en blev brugt i analysen.

evolutionær ændring i planter træk blev vurderet i planter af den 11.generation ved hjælp af multivariat lineær diskriminerende funktionsanalyse og univariate generelle lineære modeller (GLM). For GLM blev hvert træk brugt som den afhængige variabel, replikeres som tilfældig faktor og behandling som fast faktor med LSD post-hoc test. At diskriminere virkningen af naturlig selektion fra drift, vi vurderede, om trækforskelle var konsistente blandt replikater af en given bestøvningsbehandling. I GLM-analysen indikerer en signifikant ‘behandlingseffekt’ trækforskel mellem forskellige pollinatorgrupper på tværs af alle replikater og diskriminerer således pollinatorspecifik udvikling fra drift. Drift vil kun blive indikeret ved evolutionære ændringer i nogle (tilfældige) replikater, angivet med en betydning i faktoren ‘replikere’ eller interaktion mellem ‘replikere’ og ‘behandling’. Selvkompatibilitet og autonom selfing blev også vurderet af GLM, men værdier af første generations planter blev inkluderet i analysen. Til analyserne af flygtige stoffer og nektarvolumen blev data Ln(1+gange) transformeret til at nærme sig normalfordeling. For GLM med farvevariablerne blev der udført en PC-analyse som beskrevet ovenfor, men uden forudgående standardisering af variablerne. PC-analysen blev udført for alle behandlinger, replikater og alle generationer sammen, hvilket resulterede i fire pc ‘ er, der forklarede 96,9% af den samlede varians. Hyppigheden af nektarløse blomster blev analyseret separat for hver generation ved hjælp af generaliserede lineære modeller med bimodal fordeling med ’tilstedeværelse af nektar’ (ja/nej) som den afhængige variabel og behandling og replikering som faktorer. Træk i nektariferous og nektarløse blomster blev sammenlignet for den niende og ellevte generation sammen ved hjælp af generelle lineære modeller med træk som den afhængige variabel og ’tilstedeværelse af nektar’ og behandling som faste faktorer. De første valgpræferencer for humle og svævefly blev analyseret ved binomial test (test-prop=0,5; alle replikater samlet). Korrelationer mellem nektar-og planteegenskaber blev beregnet for alle generationer kombineret ved hjælp af Pearson-produktmomentkorrelationer med ln-transformerede værdier. Statistik blev udført med IMB SPSS statistik (Version 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

datatilgængelighed