| mag vs resolution | working distance | monocular parts | care of the microscopes |
| monocular focusing | oil immersion | measuring field diameter | binocular parts | binocular focusing | PDF version| Microscopy Exercises |

A. Introduktion

det typiske sammensatte lysmikroskop (Fig.1) er i stand til at øge vores evne til at se detaljer med 1000 gange, så objekter så små som 0,1 mikrometer (um) eller 100 nanometer (nm) kan ses. Elektronmikroskoper udvider dette interval yderligere,så vi kan se objekter så små som 0, 5 nm i diameter eller omtrent 1/200.000 th den størrelse, vi kan se med det blotte øje. Det er overflødigt at sige, at udvikling og brug af mikroskoper har forbedret vores forståelse af celler og deres struktur og funktion betydeligt.

Figur 1. Binokulært sammensat mikroskop.

B. forstørrelse, opløsning og Arbejdsafstand

forstørrelse er simpelthen en funktion til at få et objekt til at se større ud, f.eks. Blot at forstørre et objekt uden en samtidig stigning i mængden af detaljer set vil ikke give seeren et godt billede. Et mikroskops (eller øjes) evne til at se detaljer er en funktion af dets opløsningsevne. Opløsningsevne defineres som den mindste afstand mellem to objekter, hvor objekterne bare kan skelnes som separate og er en funktion af bølgelængden af det anvendte lys og kvaliteten af optikken. Generelt er jo kortere bølgelængden af lyskilden, jo højere er mikroskopets opløsning.

arbejdsafstand er afstanden mellem objektivlinsen og prøven. Ved lav forstørrelse er arbejdsafstanden relativt lang. Når du øger forstørrelsen, falder arbejdsafstanden dramatisk. Olie nedsænkning linser pactisk røre prøven. Vær opmærksom på denne ændring i Arbejdsafstand med stigende forstørrelse for at forhindre skade på dine prøver.

øverst på siden

C. dele af det monokulære sammensatte lysmikroskop:

tag dig tid til at gøre dig bekendt med dit mikroskop og dets korrekte anvendelse. Kontrollerne af de to mærker af mikroskoper, vi bruger i vores kurser, er vist nedenfor (Fig. 2).

figur 2. Kontrol på Leica og Olympus binokulære sammensatte mikroskoper.

1. Okulær linse eller okular: vores er 10 gange forstørrelse. De anvendelsesområder, vi vil bruge, er monokulære (kun et okular.)

2. Kropsrør: indeholder spejle og prismer, der leder billedet til den okulære linse.

3. Nosepiece: holder objektivlinserne, roterer, bemærk de positive stop for hver linse.

4. Objektiver: normalt 3-4 på vores scopes, 4H, 10h, 43h, 100H olie nedsænkning (rød banding). Total forstørrelse = okulær effekt med objektiv effekt.

5. Scene: platform, hvorpå dias er monteret til visning; nogle anvendelsesområder har mekaniske trin. Lær, hvordan du klipper diaset korrekt på plads.

6. Membran: membranen styrer mængden af lys, der passerer til prøven og kan drastisk påvirke billedets fokus. LÆR AT BRUGE MEMBRANEN SÅ HURTIGT SOM MULIGT. DE FLESTE PROBLEMER, DU VIL HAVE FOKUSERING, SKYLDES FORKERT JUSTERING AF LYS.

Vi har to typer:

• iris membran: se efter en håndtag lige under scenen nær fronten.
• dial type: lige under scenen er en roterende urskive med forskellige størrelsesåbninger (huller); denne type er nyttig til at skabe en pseudo mørk felteffekt.

7. Fokuseringsknapper: placeret på siden af mikroskopet; yderste er det fine fokus og inderste er det grove fokus.
8. Lyskilde: vores anvendelsesområder har indbygget lyskilder. Trykknappen er placeret (oftest) bag lyslinsen på bunden.

øverst på siden

D. Pleje og håndtering af det sammensatte mikroskop

der er kun et par absolutte regler, der skal overholdes ved pleje af de mikroskoper, du vil bruge. Taget sig af, disse instrumenter vil vare mange årtier og fortsætte med at fungere godt. Rapporter eventuelle fejl straks til din instruktør.

1. Brug altid to hænder til at bære omfanget-en på armen og en under bunden – ingen undtagelser! Bær aldrig omfanget på hovedet, for den okulære kan og vil falde ud.

2. Brug linsepapir til at rengøre alle linser før hver laboratoriesession og efter brug af oliedypningslinsen. BRUG ALDRIG, IKKE NU, ALDRIG ANDET END LINSEPAPIR TIL AT RENGØRE LINSERNE. Andre papirer er for urene og vil ridse den optiske belægning på linserne. Brug heller ikke væsker ved rengøring af linserne – kun LINSEPAPIR!

3. Brug altid den rigtige fokuseringsteknik for at undgå at ramme objektivlinsen i et dias – dette kan ødelægge objektivlinsen og/eller ødelægge et dyrt dias.

4. Sluk altid lyset, når du ikke bruger omfanget.

5. Placer altid ledningen forsigtigt ud af skade. Ledninger, der er sløjfet i benrummet, inviterer til en større mikroskopkatastrofe. Prøv at skubbe ledningen ned gennem skuffehåndtagene ved siden af din bænkplads.

6. Udskift altid dækslet på mikroskopet, når du lægger det væk

øverst på siden

E. Fokuseringsprocedure: monokulære sammensatte mikroskoper

1. Tænd for lyskilden.

2. Skift til objektivlinsen på 10 gange.

3. Gå tilbage på det grove fokus for at hæve næsestykket.

4. Placer objektglasset på scenen og fastgør det i den rigtige position. Se på diaset, og placer det, så prøven er over lysåbningen i scenen.

5. Nedre objektiv linse til nedre grænse (tæt på dias). Løft linsen ved hjælp af den grove fokuseringsknap, indtil du ser billedet komme i fokus, og gå derefter ud igen, og fokuser derefter tilbage, indtil du finder centerfokus. Juster fint fokus på samme måde.

6. Centrer billedet og juster lyset ved hjælp af membranen.

7. Recenter og juster fokus, først groft, derefter fint fokus som i trin 5.

8. Juster membranen efter behov.

9. Skift nu mål til 43 gange, hvis der er behov for en højere forstørrelse. Juster fint fokus og lys (membran) efter behov.

vores scopes er parfokale, hvilket betyder, at når du skifter fra lav (100 gange) til høj (430 gange) effekt, vil et fokuseret billede ved lav effekt forblive mere eller mindre i fokus ved den højere effekt. Mest sandsynligt bliver du nødt til at justere det fine fokus og membranen lidt.

øverst på siden

F. olie nedsænkning Procedure

på nogle af vores monokulære, og alle de binokulære sammensatte mikroskoper, vi har 100 gange olie nedsænkning linser. Disse kan identificeres ved et rødt bånd omkring linsens hus. 500 gange brydes lys for meget, når det passerer gennem luft for at give god opløsningsevne. Således er optik til disse højere forstørrelser lavet til brug med en høj kvalitet mineralolie som medium til transmission af lys. Det er bydende nødvendigt, at du kun bruger nedsænkningsolie, og at du rengør linsen grundigt med linsepapir efter hver brug.

1. Find området af interesse på dit dias og centrere det på 430 gange.

2. Løft objektivlinsen til sin grænse (dvs., maksimere afstanden mellem scenen og mål) og svinge linsen ud af vejen omkring halvvejs til den næste position.

3. Anbring forsigtigt en lille dråbe nedsænkningsolie direkte på objektglasset over midten af regionen af interesse.

4. Drej oliedybningsmålet på plads, og sænk det forsigtigt, mens du kigger fra siden, ved hjælp af den grove fokusknap, indtil linsen bare kommer i kontakt med oliedråben. Du vil se dråben springe op i en kolonne, når kontakten oprettes.

5. Sænk linsen en smidgen mere, og fokuser derefter på prøven ved hjælp af det fine fokus og kigger gennem den okulære linse.

6. Når du er færdig, skal du rengøre linsen med linsepapir, indtil der ikke kommer mere olie ud, og rengør glideren, hvis den skal gemmes.

øverst på siden

G. bestemmelse af Synsfeltdiameter

du ønsker måske at estimere størrelsen på prøverne (f.eks. celler), du vil se i laboratoriet. Den bedste måde at gøre dette på er med en okulær mikrometer, en præcisions okulær linseindsats, der har en lineal ætset i glas. De monokulære anvendelsesområder, vi bruger i de indledende kurser, er ikke så udstyrede, så vi bruger en alternativ metode baseret på at kende synsfeltdiameteren til dit særlige mikroskop. For at gøre dette skal du bestemme:

• den omtrentlige diameter af dit synsfelt med lav forstørrelse for dit bestemte mikroskop.
• den samlede forstørrelse for hver af dine andre objektivlinser.

Når du kender dette for hver objektiv linse, kan du sammenligne størrelsen på prøven med den kendte feltdiameter og skabe et rimeligt esimat af størrelse. Denne teknik virker for ethvert mikroskop.

1. Få en diasskala og placer den på dit omfang. En gennemsigtig metrisk lineal fungerer også.

2. Bring det i fokus ved hjælp af målet på 10 gange (100 gange i alt). Skalestængerne er trin på 1 mm som vist i nedenstående figur. Således er en sort bjælke = 0,5 mm ligesom et mellemrum.

3. Flyt diaset således, at kanten af en udvendig sort bjælke bare er tangent til det oplyste felt (se punkt “A” ovenfor).

4. Start ved den kant, anslå, hvor mange søjler og mellemrum det tager at krydse synsfeltet. Du bliver sandsynligvis nødt til at estimere den sidste brøkdel af et mellemrum eller en bjælke. For de fleste af vores mikroskoper er den cirka 1,8 -2,0 mm bred. Du skal kontrollere dette på ethvert mikroskop, du bruger, der ikke har en okulær mikrometer.

5. Registrer dit omfangs ID-nummer og feltdiameter til 100 gange i din lab-notesbog til fremtidig reference.

6. Beregn derefter feltbredden ved 430 gange Total forstørrelse ved hjælp af følgende formel (vi henviser til 100 gange mag som “lav effekt” og 430 gange som “høj effekt”):

(lav effekt mag/ høj effekt mag) lav effekt feltdiameter (i mm)

Antag f.eks., at du bestemmer, at feltdiameteren på 100 gange er 1,8 mm, ved 430 gange vil feltdiameteren være:

(100 / 430) 1,8 mm = 0,418 mm = 418 um (mikrometer)

bemærk, at feltdiameteren ved høj effekt er proportional med forholdet mellem målene med lav til høj effekt. Det vil sige, når du øger forstørrelsen, bliver det faktiske synsfelt proportionalt mindre.

øverst på siden

H. binokulære sammensatte lysmikroskoper
dele af lysmikroskopet

1. Okulær linse eller okular: vores er 10 gange forstørrelse. De anvendelsesområder, vi vil bruge, er kikkert (to okularer).

2. Kropsrør: indeholder spejle og prismer, der leder billedet til de okulære linser.

3. Næsestykke: holder objektivlinserne, roterer

4. Objektiver: normalt 3-4 på vores scopes, 4H, 10h, 43h, 100H olie nedsænkning (rød banding). Total forstørrelse = okulær effekt med objektiv effekt. De fleste af vores kikkert har faste positionslinser-scenen bevæger sig op og ned snarere end linsen.

5. Scene: bevægelig platform, hvorpå dias er monteret til visning; alle vores scopes har mekaniske trin med vernier skalaer. Fokus drejeknapper flytte scenen op og ned.

6. Kondensator: en substage linse, der fokuserer lyset på prøven. Vores kikkert har kondensatorer, der bevæger sig op og ned for at fokusere lysstrålen.

7. Iris Membran: membranen er placeret lige under scenen og styrer mængden af lys, der passerer til prøven og kan drastisk påvirke billedets fokus.

8. Fokusering drejeknapper: yderste er den fine fokus og inderste er den grove fokus. På kikkerten styrer disse knapper op / ned bevægelse af scenen.

9. Lyskilde: vores anvendelsesområder har indbygget lyskilder. Reostat ON / OFF-kontakten er placeret enten på omfanget eller på den eksterne strømforsyning og bruges til at regulere lysintensiteten.

øverst på siden

I. Fokuseringsprocedure: Binokulære sammensatte mikroskoper

1. Tænd for lyskilden. Binoc scopes har enten en indbygget enhed eller en ekstern strømforsyning.

2. Skift til objektivlinsen på 10 gange.

3. Juster det grove fokus for at hæve næsestykket (eller sænke scenen).

4. Klip objektglasset på scenen i den rigtige position.

5. Se på de okulære linser i dit omfang. Den ene linse er fast, og den anden har en fokuseringsring (som et kikkert). Bring linsen så tæt på diaset som muligt, og kig derefter kun gennem den faste okulære linse, tilbage, indtil prøven bare kommer i fokus. Juster fint fokus på samme måde for den faste linse.

6. Nu ser du kun gennem den justerbare okular, juster dens fokus ved hjælp af fokusringen omkring linsen. Se med begge øjne (Juster for interpupillær afstand for at se et enkelt rundt oplyst felt) og foretag mindre justeringer for at fokusere.

7. Centrer billedet og juster lyset ved hjælp af kondensorlinsen, irismembranen og lyskilden reostat.

8. Recenter og juster fokus, først groft, derefter fint fokus som i 5.

9. Juster membranen efter behov.

10.Skift nu mål til en højere magt. Juster fint fokus og lys (membran) efter behov.

vores scopes er parfokale, hvilket betyder, at når du skifter fra lav til høj effekt, vil et fokuseret billede ved lav effekt forblive mere eller mindre i fokus ved den højere effekt. Mest sandsynligt bliver du nødt til at justere det fine fokus og membranen lidt (øge lyset ved højere kræfter.

Modified 11-6-15 gja

Department of Biology, Bates College, Lewiston, ME 04240