Experimentální design a studijního systému

V roce 2012, 300 semen rychle cyklistika Brassica rapa rostliny (Wisconsin Rychle Rostlin Standardního Osiva, s vysokou genetickou variabilitu) byly získány od Carolina Biologické Potřeby, a pěstovány v phytotron podle standardizované půdě, světlo a zálivku podmínky. Tyto rostliny jsou plně outcrossing (self nekompatibilní) a mají dostatek stálých genetických variací, aby snadno reagovaly na selekci58, 59. Z těchto 300 rostlin, 108 plný sib semen rodiny byly vytvořené umělé přechody (pouze osivo rodin z kříže, kde oba rodiče produkoval ovoce byly použity). Těchto 108 celých sibiřských rodin bylo použito jako výchozí populace pro experiment.

pro první generaci experimentu byly vytvořeny tři léčebné skupiny s použitím 108 rodin, takže každá rodina byla v každé léčbě zastoupena ke kontrole genotypu mezi léčbami (Doplňkový obr. 1). Každé ošetření se proto skládala z 108 zařízení (což představuje 108 semen rodin), které jsme dále dělí na tři opakování (A,B,C), každý obsahující 36 rostlin. Replikáty v rámci léčby byly udržovány jako izolované linie během 9 generací (nebyly provedeny žádné křížení mezi replikacemi), aby bylo možné posoudit nezávislé, opakovatelné evoluční změny. Rostliny všech replikátů ve všech ošetřeních byly pěstovány ve fytotronu za standardizovaných podmínek půdy (Einheitserde classic), světla (24 h světla) a zalévání. Všechny rostliny byly fenotypizovány každou druhou generaci počínaje generací 1. Údaje o květinové vůni z generací 1 a 3 byly ztraceny kvůli technickým problémům; namísto, vůně byla shromážděna z generace 4. Údaje o květinové vůni generace 1 byly získány po skončení experimentu opětovným pěstováním rostlin z počáteční generace a sběrem vůně z jedné rostliny z každé ze 108 rodin semen. Z první generace bylo tedy odebráno celkem 108 rostlin (36 z každé replikace) pro květinovou vůni současně s rostlinami generace 9.

Experimentální vývoj a opylení léčby

V naší studii jsme použili tři opylovač ošetření: čmeláci („BB“, Bombus terrestris, Biocontrol, Andermatt, Švýcarsko), hoverflies („HF“, Episyrphus balteatus, Katz Biotech AG, Německo) a ručního opylování. Oba hmyzu snadno navštívit květiny mnoha druhů Brassicaceae v přírodě, ale představují různé funkční opylovač kategorií, a bylo prokázáno, že se liší v hojnosti v přírodní habitats46. Použití jednotlivých druhů opylovačů napodobuje prostředí opylovačů, ve kterých jsou nejhojnější opylovače funkčně odlišné. Při kontrolním ošetření („CO“) byly náhodně vybrané rostliny křížově opylovány ručně.

Opylení bylo provedeno 23 dní po výsevu v letu klece (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m) ve skleníku za standardizovaných světelných podmínek s čmeláci a hoverflies. Pokusy byly prováděny mezi 0900 a 1 500 hodinami. Čmeláci byli drženi v samostatné letové kleci ve skleníku. Hoverflies byly zakoupeny jako kukly a chovány až do vylíhnutí, po kterém byly samčí a samičí mouchy odděleny. Opylovači bylo dovoleno, aby píce na rychle, cyklistika B. rapa rostliny (rostliny z kontrolní skupiny dané generace) a fed s další pyl až do 3 dnů před opylení léčby; poté, pouze pylu a cukru v roztoku byly poskytnuty; 16 h. před opylení, opylovači byli hladoví.

pro opylení byly všechny rostliny jedné replikace náhodně umístěny na čtverec 6 × 6 rostlin ve vzdálenosti 20 cm od sebe v letové kleci. Pět opylovačů byly přidány jednotlivě a postupně, a každý z hmyzu bylo dovoleno navštívit maximálně tři různé rostliny a pak se odstraní z klece; každá hmyzu byl použit pouze jednou. Celkem 12-15 rostlin na repliku obdrželo jednu nebo více návštěv opylovačů. Celkový průměr (±s.d.) počet návštěv (v navštívených zařízeních) byl 1.35±0.63 pro bumblebee-opylovaný rostlin, a 1.28±0.53 pro hoverfly-opylovány rostliny. U navštívených rostlin byl zaznamenán počet návštěv a počet navštívených květin. V kontrolní skupině, 12 rostliny byly vybrány náhodně na replikaci a 5 květy každé rostliny byly ručně opylovány jednou náhodně vybranou otcovskou rostlinou; otcové byli vybráni ze stejných 12 rostliny. Každá rostlina může být dárcem pylu pro více než jednu rostlinu, ale pyl získala pouze z jedné rostliny. Po opylení byly navštívené květiny označeny a rostliny byly drženy v kleci dalších 30 dní, dokud nebyly plody shromážděny. Semena byla započítána a relativní sada osiva byla vypočtena pro každou rostlinu vydělením jednotlivého souboru osiva průměrným osivem stanoveným v replikaci. Kromě toho byl pro každou navštívenou rostlinu vypočítán počet semen na ovoce. Pro každou rostlinu byla odhadnuta způsobilost mužů jako předpokládaná otcovství (počet událostí exportu pylu).

Ze všech semen vyrábí opylovány květiny, podmnožina semena zástupce produkce osiva každého jednotlivého byl použit růst příští generace. Čím více semen rostlina vyprodukovala, tím více semen přispěla k další generaci, která se opět skládala z 36 rostlin pro každou replikaci. Příspěvek osiva každé navštívené rostliny do další generace byl vypočítán pro každou replikaci jako: 36/(replikovaný součet semen/jednotlivé sady semen). Hodnoty pod 0,5 byly zaokrouhleny nahoru na 1.

Inbrední deprese

Inbrední deprese v průběhu experimentu bylo kvantifikovat pomocí měření hmotnost semen a klíčení, druhý jako procento semena vyklíčila na opakování. Ovládání pro rys-změny v důsledku inbrední deprese, semena produkované rostlinami 9. generace byly pěstovány (což představuje 10. generace) a ručně přešel mezi opakování během léčby, tak, že rostliny z každého opakování byl pyl dárce a pyl příjemce pro rostliny ze dvou různých replikátů (♀- ♂C, ♀B -♂, ♀C-♂B). Přechody v rámci těchto kombinací replikátů byly náhodné. Z výsledných semen (jedenáctá generace) byl pěstován jeden jedinec na rodinu semen (36 rostlin na replikaci) za stejných podmínek jako během experimentu. Z těchto mezireplikačních křížení, vlastnosti byly znovu měřeny a použity pro konečné srovnání vlastností mezi léčebnými skupinami.

vlastnosti rostlin

většina vlastností, včetně květinové vůně, byla měřena před opylováním, 19-21 dní po výsevu. Šířka okvětního lístku, Délka, Délka pestíku a průměr květu tří náhodně vybraných květů na rostlinu byly měřeny elektronickým třmenem (digitální třmen 0-150 mm, TOOLCRAFT). Nektar z tří květin byly shromážděny s 1 µl mikro kapilární trubky (Blaubrand, Wertheim, Německo) a objem stanoví měřením délky nektaru sloupec v mikropipeta s třmen. Pro kvantifikaci byl použit průměr tří květů. Pro 157 rostlin rovnoměrně rozdělených na ošetření byl obsah cukru v nektaru stanoven pomocí derivatizace a plynové chromatografické analýzy. Za tímto účelem byl nektar přenesen na filtrační papír uložený ve silikagelu. Odvětví na filtrační papír obsahující nektar byl řez od zbytku filtračního papíru a nektar byl eluovány v 1 ml high-čistota Mili-Q vody třepáním ředění pro 90 min s 400 r.p.m. při 60 °C na laboratorní třepačce. Poté 50 µl roztoku byly vysušeny při teplotě 60 °C a derivatizován s 100 µl směsi bezvodého pyridinu (Fisher Scientific, Geel, Belgie), hexamethylsilazane (Sigma-Aldrich, Buchs, Švýcarsko) a trimethyl (Sigma-Aldrich, Buchs, Švýcarsko) (10:5:3). Následně, vzorky byly prováděny GC-MS, jak je popsáno v ref. 32. Vypočítali jsme celkové množství cukru na květ a květenství jako součet všech různých cukrů (fruktóza, glukóza,sacharóza a sorbitol). Korelace mezi nektaru obsah cukru a nektar objem byl pozitivní a vysoké (r156=0.732; P<0.001), tak pro zbývající rostliny, pouze nektar objem byl určen. Kolekce květinové vůně byla provedena před biologickými zkouškami nedestruktivním způsobem ze všech květenství rostlin, jakmile bylo otevřeno nejméně pět květů. Použili jsme sorpci headspace se systémem push-pull59, 60. Květenství rostlin bylo uzavřeno ve skleněných válcích dříve potažených sigmacote (Sigma-Aldrich) a uzavřeno teflonovou deskou. Počet otevřených květin byl započítán pro každou rostlinu. Vzduch z okolí byl tlačen průtokem 100 ml min-1 žlabem filtrů s aktivním uhlím do skleněného válce. Současně, vzduch byl vytáhl ze skleněných válců s rychlostí průtoku 150 ml min−1 koryto skleněné trubice naplněné s ∼30 mg Tenax TA (60/80 mesh; Supleco, Bellefonte, PA, USA). Vzduch z prázdných skleněných lahví byl shromažďován jako regulace vzduchu. Květinové těkavé látky byly shromažďovány po dobu dvou hodin ve fytotronu za standardizovaných světelných a teplotních podmínek. Kvantifikace těkavých látek byla provedena plynovou chromatografií s hmotnostní selektivní detekcí (GC-MSD). Vzorky byly vstříknut do GC (Agilent 6890N; Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) Víceúčelový Sampler (MPS; Gerstel, Müllheim, Německo) pomocí Gerstel termální desorpční jednotky (TDU; Gerstel) s studený vstřikovací systém (CIS; Gerstel). Pro termodesorpci byl TDU zahříván z 30 na 240 °C rychlostí 60 °C min-1 a udržován na konečné teplotě po dobu 1 minuty. CIS byl nastaven na -150 °C během zachycení eluujících sloučenin z TDU. Pro injekci se CIS zahřívá na 250 °C rychlostí 12 °C s-1 a konečná teplota se udržuje po dobu 3 minut. GC byl vybaven kolonou HP-5 (průměr 0,25 mm, tloušťka filmu 0,25 µm, délka 15 m) a helium bylo použito jako nosný plyn při průtoku 2 ml min−1. Identifikace a kvantifikace sloučenin byly provedeny následně60 s programem Agilent MSD ChemStation. Kvantifikace sloučenin byla získána měřením špiček vybraných cílových iontů specifických pro jednotlivé vonné sloučeniny. Specifické cílové ionty byly získány ze syntetické standardy všech látek; plochy píků byly přepočteny na absolutní částky pomocí kalibrační křivky dříve získány pro každou sloučeninu s použitím syntetických sloučenin ve třech různých koncentracích. Do analýzy byly zahrnuty pouze vonné sloučeniny, které byly přítomny ve výrazně vyšších množstvích než v regulaci vzduchu (celkem 14 vonných sloučenin). Všechna množství těkavých látek byla vypočtena v pg na květ L-1 vzorkovaného vzduchu.

dvacet tři dní po vysetí, ve stejný den, kdy bylo provedeno opylení, byl zaznamenán počet otevřených květů a výška každé rostliny. Po opylení (ale ve stejný den), barva-reflektanční spektra tří lístků z různých neopylených (pokud je to možné), květy na rostlině byly zaznamenány pomocí spektrofotometr s optickými vlákny (AvaSpec-2048; Avantes, Apeldoorn, Nizozemsko) a xenonový pulzní světelný zdroj (AvaLight-XE; Avantes). Jeden lístek na čas byla umístěna do spektrofotometru (konkrétně se zaměřením na distální část plátku) a procento odrazivosti (vztaženo na bílý standard) mezi 200 a 900 nm každých 0,6 nm, byl zaznamenán v režimu přenosu. Ze změřeného spektra byl v analýze použit pouze průměr hodnot odrazivosti každých 10 nm od 260 do 650 nm od tří okvětních lístků. U rostlin jedenácté generace, podmnožina ca 20 rostliny na replikaci byla analyzována na barvu, protože žádný z barevných počítačů nebyl během experimentu selektován. Oblast ultrafialového záření, absorbuje a odráží okvětní lístek povrchu byla měřena pouze v rostlinných generace 11 s uv-citlivý digitální fotoaparát s quartz objektivu. Byly pořízeny fotografie květin a kvantifikována oblast absorbující ultrafialové záření pomocí softwarového balíčku ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

testy preferencí opylovačů

testy preferencí opylovačů byly provedeny pro každou replikaci s oběma typy opylovačů. Pro každou replikaci byly provedeny dva behaviorální testy(jeden pro každého opylovače). Rostliny opylované čmelákem a hoverfly (generace 11) každé repliky byly náhodně spárovány a umístěny vedle sebe (vzdálenost ca 30 cm) do letové klece (2,5 m × 1,8 m × 1,2 m). Jeden opylovač byl umístěn do klece a umožnil navštívit jednu rostlinu. Opylovači byli okamžitě chyceni poté, co se rozhodli. Každý pár rostlin byl testován jedním opylovačem.

Self-kompatibilita a autonomní samosprášení

test pro self-kompatibilita, pěstovali jsme rostliny z první (15 rostlin v každém opakování) a jedenáctá generace (30 rostlin v každém opakování). Jeden semen na osiva rodiny (z náhodně vybraných rodin), byl dospělý a dvě květiny na rostliny selfed na kvetení. Průměrný počet semen vyprodukovaných na samočinný květ pro každou jednotlivou rostlinu byl použit jako měření samočinné kompatibility.

pro testování autonomního samofingu jsme vypěstovali ca 12 rostlin (jedno semeno na rodinu) na replikaci z každého ošetření generace 11 a 1 (celkem 162 rostlin). Po 30 dnech, kdy se otevřely květy ca 20, byly zbývající pupeny v každé rostlině pečlivě řezány a byl zaznamenán počet otevřených květů. Rostlině pak bylo umožněno vyvíjet plody bez přístupu hmyzu k rostlinám. Po dozrání plodů byla odebrána semena a počet semen byl počítán a zvážen pro každou rostlinu. Jako měření pro autonomní selfing byl použit počet plodů na otevřený květ a semeno na ovoce. Protože několik rostlin má velmi vysoký počet plodů na otevřené květy, zrušují jsme tyto odlehlé hodnoty pro konečné srovnání autonomní samosprášení. Byl odstraněn následující počet odlehlých hodnot: 1 v generaci 1; v G11: 2 v BB, 3 v HF, 2 v CO.

Statistické analýzy

analyzovat fenotypové selekce, výběr rozdíly a přechody byly vypočteny pomocí regrese rostlin fitness na traits61. Tato analýza byla provedena samostatně pro ošetření, ale pro všechny replikace a generace dohromady. Jako odhad způsobilosti byl použit „počet návštěv“, což byla počítací proměnná a následovalo Poissonovo rozdělení. Další fitness proměnné, relativní semen‘ měl rozdělovníky zkreslená tím, že mnoho nulových hodnot; kromě toho, semen minul pouze mužské fitness součást první závod je navštívil, které nebyly set semen z této návštěvy (protože opylovači zpočátku nenesl Brassica pyl). Počet návštěv byl však silně koreluje s relativní semen (BB: r626=0.694, P<0.001; HF: r605=0.597, P<0.001). Zobecněné lineární modely (Poissonovo rozdělení) byly použity k výpočtu výběr přechody (vícerozměrné) a diferenciály (univariate) pro každé léčbě se počet návštěv jako závislé proměnné a vlastnosti jako proměnné. Kromě toho, kvadratické výběr přechody byly vypočteny všechny vlastnosti a na druhou každého znaku přidány do modelu, a následně přechody doubled62. Zkontrolovat rozdíly ve výběru mezi čmeláky a hoverflies, zobecněný lineární model (s Poisson distribuce) se počet návštěv jako závislá proměnná, léčba jako fixní faktor, znaky rostlin jako proměnné a interakce ošetření*rostliny vlastnost byla provedena. Před analýzou výběru byly všechny proměnné standardizovány na střední hodnotu=0 a s. d.=1 (z-hodnoty) na úrovni replikace. Zobecněný lineární model byl také použit k porovnání míry návštěvnosti mezi čmelákem – a rostliny opylované hoverfly napříč všemi generacemi. Hodnoty květinového barevného spektrofotometru byly sníženy analýzou hlavní komponenty (PC)s rotací varimax. V analýze byly použity pouze počítače s vlastní hodnotou nad jednou.

evoluční změna vlastností rostlin byla hodnocena u rostlin 11. generace pomocí analýzy vícerozměrných lineárních diskriminačních funkcí a jednorozměrných obecných lineárních modelů (GLM). Pro GLM, každá vlastnost byla použita jako závislá proměnná, replikovat jako náhodný faktor a léčba jako fixní faktor s LSD post-hoc testem. Rozlišovat dopad přirozeného výběru od driftu, posoudili jsme, zda jsou rozdíly mezi znaky konzistentní u replik daného opylení. V analýze GLM významný „léčebný“ účinek naznačuje rozdíl mezi různými skupinami opylovačů ve všech replikacích, a tak rozlišuje vývoj specifický pro opylovače od driftu. Drift by být indikována evoluční změny v některých (random), opakování pouze, je indikováno význam v faktor ‚kopírovat‘, nebo interakce mezi ‚kopírovat‘ a ‚léčba‘. Samokompatibilita a autonomní samokompatibilita byly také hodnoceny GLM, ale do analýzy byly zahrnuty hodnoty rostlin první generace. Pro analýzu těkavých látek a objemu nektaru byla data Ln (1+x) transformována tak, aby se přiblížila normální distribuci. Pro GLM s barevnými proměnnými byla provedena PC analýza, jak je popsáno výše, ale bez předchozí standardizace proměnných. PC analýza byla provedena pro všechna ošetření, opakování a všemi generacemi dohromady, což má za následek čtyři Ks vysvětlovat 96,9% celkového rozptylu. Frekvence květů bez nektaru byla analyzována samostatně pro každou generaci pomocí zobecněných lineárních modelů s bimodální distribucí, s „přítomností nektaru“ (ano / ne) jako závislou proměnnou a ošetřením a replikací jako faktory. Rysy v nectariferous a nectarless květiny byly porovnány pro deváté a jedenácté generace společně, pomocí obecných lineárních modelů s rysem, jako závislá proměnná, a přítomnost nektaru a zacházení jako fixní faktory. Preference první volby čmeláků a vznášedel byly analyzovány binomickým testem (test-prop=0,5; všechny repliky sdružené). Korelace mezi nektarovými a rostlinnými vlastnostmi byly vypočteny pro všechny generace kombinované pomocí korelací Pearsonův produkt-moment s hodnotami transformovanými ln. Statistiky byly provedeny pomocí statistik IMB SPSS (verze 20.0.0, http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/products/statistics/).

dostupnost dat