návrh experimentu a sběr vzorků

experiment byl založen v roce 1982 v Mengcheng county, provincii Anhui, Čína (33° 13′ N, 116° 35′ E, 42 m převýšení) s typickými vápna zhutnění černé půdy. Roční teplota je 14,8 °C a roční srážky 872 mm. Pět hnojení ošetření pšenice-sója, střídání plodin byly porovnány v zcela náhodně blok design s čtyři opakování (každý pozemek je 70 m2) : (1) ovládání, non-hnojení; (2) NPK, NPK hnojiva obsahující močovinu (180 kg N ha−1 rok−1), superfosfátu (90 kg P2O5. ha−1 rok−1) a chlorid draselný (86 kg K2O. ha− 1 y−1); (3) NPK + WS, NPK hnojiv, chemických plus 7500 kg pšeničné slámy ha−1 rok−1; (4) NPK + PM, NPK hnojiv, chemických plus 15,000 kg čerstvého vepřového hnoje ha−1 rok−1; (5) NPK + CM, NPK chemická hnojiva plus 30 000 kg čerstvého kravského hnoje ha – 1 rok-1. Při ošetření NPK + WS byla veškerá pšeničná sláma vrácena na pole, prasečí hnůj v ošetření NPK + PM a kravský hnůj v NPK + CM měl podobné množství organického uhlíku s přidanou pšeničnou slámou. Kromě toho, tyto kontrastní typy hnojiv zahrnuty v naší hnojení ošetření mají různé úrovně dostupnosti pro rostliny a mikroby, například, z více labilní (prasečí kejda) více vzpurné (pšeničné slámy a kravského hnoje). Použili jsme širokou škálu ošetření hnojení s cílem učinit naše výsledky reprezentativními a použitelnými pro kontrastní postupy řízení.

vykopali jsme skupinu pšenice (obsahující 30 až 40 rostlin pšenice během fáze plnění pšenice 20. Dubna 2017), abychom udrželi kořenové systémy co nejintenzivnější. Půda rhizosféry, která byla pevně přilepena ke kořenům, byla poté kartáčována. Současně byla ornice (hloubka 0-15 cm) shromážděna jako sypká půda pomocí vrtáku (přibližně 20 cm od rostlin). Shromážděná půda byla proseta přes síťku 2 mm, aby se odstranily nečistoty, jako jsou kořeny a kameny. Část půdy byla uložena při 4 °C pro chemické analýzy a zbytek byl uložen při-40 °C pro extrakci DNA.

fyzikálně-chemická analýza půdy

k měření pH půdy při poměru půda/destilovaná voda 1:5 (hmotnost / objem) byl použit pH metr (FE20 Fiveeasy™, Mettler Toledo, Německo). Vlhkost půdy byla stanovena gravimetricky sušením 5 g čerstvé půdy na přibližně 105-108 °C do dosažení konstantní hmotnosti a poté se vypočítá hmotnostní poměr (odpařené vody, aby sušené půdy). Celkový uhlík (TC) a celkového dusíku (TN) obsah půdy byly stanoveny pomocí spalovacího vzduchu vysušené půdy pomocí CNS-2000 analyzátor (LECO, St. Joseph, MI, USA), po prosévání půdy prostřednictvím 0,15 mm. Celkový obsah fosforu (TP) a celkového draslíku (TK) v půdě byl extrahován po trávení HF-HClO4 a měřen metodou molybdenové modři a metodou plamenové spektrofotometrie (FP640, INASA, Čína). Rozpuštěný organický uhlík (DOC), byl získán přidáním 50 mL destilované vody, 5 g čerstvé půdy, třepání po dobu 1 h a podtlak filtrování přes G4, filtr ze skleněných vláken s pórů 1,2 µm (Fisher), a pak obsah uhlíku v extraktech byl stanoven obsah celkového organického uhlíku v analyzátoru (multi N/C 3000, Analytik Jena, Německo). Dusičnan (NO3–N), amonium (NH4+-N) A rozpuštěný celkový dusík (DTN) byly extrahovány v poměru 5 g čerstvé půdy k 50 mL 2 M KCl. Po tom, žít po dobu 1 h, výtažky byly filtrovány přes G4, filtr ze skleněných vláken s pórů 1,2 µm (Fisher), a pak, nepřetržitý tok analytického systému (San++ systém Skalar, Holandsko) byl použit pro analýzu obsahu NO3–N, NH4+-N, DTN. Rozpuštěný organický dusík (DON) byl vypočítán pomocí následujícího vzorce: DON = DTN-NH4+ – N-NO3–N. dostupný fosfor (AP)v půdě byl extrahován 0.5 M NaHCO3 a stanoveno metodou molybdenové modři. K dispozici draslíku (AK) byla extrahována 1 M octanu amonného a určí plamen fotometr (FP640, INASA, Čína) (Další soubor 3: Dodatek 1).

Stanovení dusíku fixace sazby

15N2-způsob značení je jedním z nejběžnějších a široce používaných metod používaných pro měření N fixace sazby . Pět gramů půdy byly umístěny do 18 × 150 mm Balch trubky, a headspace byl nahrazen syntetickým vzduchem, obsahující 80% 15N2 a 20% O2. Ovládací prvky byly naplněny neoznačeným plynem N2 a zpracovány paralelně. Zkumavky byly inkubovány vodorovně ve tmě při pokojové teplotě po dobu 22 dnů. Atom % 15N vzorků půdy byl stanoven pomocí hmotnostního spektrometru stabilního poměru izotopů (Flash 2000 HT / Conflo IV / Delta V, Thermo Fisher Scientific, Německo). Pak, vypočítali jsme míru fixace čistého potenciálu N porovnáním rozdílu celkových 15N v půdách přijímajících 15N2 vzhledem k kontrole.

vysoce výkonná sekvenační a bioinformatická analýza

pro extrakci DNA, 0.5 g čerstvé půdy bylo použito se sadou Fast DNA SPIN (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). Geny nifH byly amplifikovány pomocí párů primerů nifH-F/nifH-R (5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′)/(5 ‚- TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3‘). PCR reakce byly provedeny v 20 µL reakce obsahující 4 µL 5 × FastPfu pufru, 2 µL 2,5 mM dntp, 0.8 µL 5 µM přímý primer, 0.8 µL 5 µM reverzní primer, 0.4 µL fastPfu Polymerázy, 10 ng templátové DNA, a dvakrát destilovaná voda (ddH2O). Amplifikace byla provedena na 95 °C po dobu 3 min, 35 cyklů 95 °C po dobu 30 s, 55 °C po dobu 30 s a 72 °C po 45 s a extenze při 72 °C po dobu 10 min. PCR amplikony byly čištěny pomocí Agarózového Gelu DNA purification kit (TaKaRa Bio), a trojím provedení PCR amplifikace pro každý vzorek byly provedeny a sdružená jako PCR produktu a poté sekvenovány na platformě Illumina MiSeq PE300 (Majorbio Společnost v Shanghai, Čína). Po sekvenování byly nifh nukleotidové sekvence analyzovány pomocí potrubí QIIME-1.9.1 (http://qiime.sourceforge.net/). Za prvé, low-kvalitní sekvence (ty s skóre kvality < 20, obsahující nejednoznačná nukleotidů, nebo není odpovídající primeru a čárový kód) byly odstraněny a zbývající sekvence byly dále převedeny do sekvencí aminokyselin pomocí FunGene Potrubí Ribozomální Databáze Projektu . Sekvence kódující proteiny, které neodpovídaly sekvenci proteinu nifH nebo které obsahovaly terminační kodony, byly vyřazeny. Zbývající sekvence byly zarovnány s databází genů nifH, odstranění selhaných i chimérických sekvencí. Zbývající vysoce kvalitní sekvence byly seskupeny do operačních taxonomických jednotek (OTUs) na 95% podobnosti s UCLUST běží v de novo režim, a všechny singleton OTUs byly odstraněny.

Co-výskyt síťové analýzy

vytvořili Jsme co-výskyt síť se všemi vzorky (rhizosféry a sypké půdy) a identifikovat hlavní ekologické shluky silně spojený OTUs. Byli vybráni nejvyšší OTUs, představující více než 80% relativní hojnosti v celkové komunitě . Všechny dvojice-chytrá Spearman korelace mezi OTUs byly vypočteny, a korelace s Spearmanův koeficient menší než 0,65 a P hodnota je vyšší než 0,01, byly odstraněny. To nám umožnilo soustředit se pouze na OTUs, který silně koexistoval a byl pravděpodobnější, že bude vzájemně komunikovat. Hlavní moduly (ekologické klastry) v síti byly vizualizovány pomocí Gephi (https://gephi.org/). Relativní hojnost každého ekologického klastru byla vypočtena zprůměrováním standardizovaných relativních hojností (Z-skóre) druhů, které k němu patřily (další soubor 3: Dodatek 3).

Statistické analýzy

ANOVA a párové t-testy byly použity k porovnání půdě proměnné, dominantní mikrobiální taxony, a mikrobiální alfa diverzity mezi různými hnojení ošetření (Další soubor 3: Dodatek 1). Tyto testy byly realizovány pomocí SPSS 21. K analýze korelací mezi diazotropní komunitou a fyzikálně-chemickými vlastnostmi byl použit mantelový test (další soubor 3: Dodatek 2). Toto bylo provedeno pomocí“ veganského “ balíčku v r × 32 (3.2.2). Hlavní koordinovat analysis (PCoA) byl použit k najít významné rozdíly v diazotrophic společenství mezi vzorkovací skupiny (Další soubor 3: Dodatek 2). PCoA byla provedena pomocí balíčku „labdsv“ R × 32 (3.2.2) (http://cran.stat.sfu.ca/).

fylogenetické analýzy

Gen nifH poskytuje dostatečné fylogenetické rozlišení v ekologických studiích. Fylogenetický strom pro 481 dominantních diazotrofních fylotypů v ekologických klastrech byl postaven pomocí FastTree a vizualizován pomocí GraPhlAn . Fylogenetická vzorků teorie může být analyticky zaměstnán (za předpokladu, že náhodný výběr z fylogenetický strom jako předpokládané fylogenetické diverzity v místní komunitě, a pak porovnáním pozorované fylogenetické rozmanitosti se tyto předpovědi) určit, do jaké míry diazotrophic společenství se objeví náhodně (mezi − 2 a + 2), nad-rozptýlené (nad + 2), nebo sdružené (pod − 2). Fylogenetická teorie vzorkování byla provedena pomocí balíčku R „picante“. Výhodou náhodného odběru regionálního fylogenetického stromu je to, že jej lze použít k porovnání vzorků nerovných velikostí na základě binomického vzorkovacího modelu . Rozdíly mezi pozorovanou a očekávanou fylogenetickou rozmanitostí byly stanoveny výpočtem a porovnáním Z-skóre pro každý ekologický klastr. Když pozorované fylogenetické rozmanitosti je méně, než se očekávalo rozmanitosti (viz níže − 2), mikrobiální společenství v ekologické clusteru je považován za fylogeneticky clusteru, což znamená, že blízce příbuzné taxony jsou více pravděpodobné, že bude do vzorku a aktivně vybrané prostředí .

analýza modelování strukturních rovnic

sem byla provedena pomocí IBM SPSS Amos 21 (Chicago, IL: Amos Development Corporation). Byl použit k vyhodnocení přímých a nepřímých účinků fyzikálně-chemických vlastností půdy a relativní hojnosti hlavních ekologických shluků na n fixační sazby. Fyziochemické vlastnosti půdy zahrnovaly pH půdy, celkový uhlík, celkový dusík a celkový fosfor. V modelu, ošetření (kontrola, NPK, NPK + WS, NPK + PM, NPK + CM) byly kategorické proměnné se dvěma úrovněmi: 1 (zvláštní zacházení) a 0 (zbývající považován za ošetření). Kromě toho, bootstrapping byl použit k testování pravděpodobnosti, že koeficienty cesty se lišily od nuly, protože několik proměnných nebylo normálně distribuováno. Také jsme spočítali, standardizované celkové účinky (STEs) vlastnosti půdy, hnojení, ošetření, a rhizosféry vliv na N fixace sazby na podporu výkladu SEM.

Random Forest modelování, analýzy

Random Forest regrese (R balíček „randomForest“) byl použit k regresi normalizované OTUs v různých procedur. 10-násobná metoda křížové validace byla použita ke stanovení optimální sady OTUs korelovaných S N fixačními sazbami . Zařadil seznamy OTUs v pořadí Náhodných Lesů hlásil, funkce, význam skóre bylo dosaženo na základě zvýšení mean-square error dusíku fixace sazby předpověděl více než 100 iterací algoritmu. 50 markerových OTUs bylo vybráno na základě minimálních průměrných chyb křížové validace, které byly získány z pěti studií 10násobné křížové validace.