Kostní minerální: nové pohledy na jeho chemické složení
Identifikace HPO4 2− iontů v minerální kostní
direct solid-state Nukleární Magnetické Rezonance (ssNMR) detekce protonů lokalizované v kostní minerální od intaktní kostní tkáně vzorku není možné. To je způsobeno přítomností extracelulární organické matrice, jejíž různé signály dominují spektru 1h single pulse (SP) ssNMR vzorku kostní tkáně54. Nicméně, možnost odhalit atomová měřítku prostorové proximities mezi vodíkem a fosforem jádra ve dvou-dimenzionální (2D) {1H}a 31P Heteronuclear Correlation (HetCor) ssNMR experiment umožňuje snímání kostní minerální vodíku prostředí prostřednictvím analýzy F1 rozměr (Obr. 1A). Tento experiment je bohužel časově náročný a vede k 1h projekci vertikální (F1) dimenze s relativně špatným poměrem signál-šum (S/N) A nízkým digitálním rozlišením (obr. 1B). K překonání těchto omezení jsme použili jednorozměrný (1D) {1H-31P}1h pokus o dvojitou křížovou polarizaci (CP) ssNMR. Skládá se z dvojitého přenosu CP prováděného způsobem “ tam a zpět „(1H→31P→1H) (obr. S1). Za prvé, tento experiment nám umožnil získat 31P-filtruje 1H ssNMR spektra kostního minerálu z intaktní, kortikální 2-rok-staré ovce kostní tkáně, vzorek s vynikající S/N přes relativně krátký čas pořízení (tj., 9 hodin) (Obr. 1C, D). Různá 1H chemická prostředí z kostního minerálu jsou nyní snadno pozorovatelná a lze je bezpečně analyzovat s přesností. S ohledem na vnitřní krystalické jádro kostních minerálních částic jsou hydroxylové ionty přítomné v krystalové mřížce hydroxyapatitu pozorovány ve formě komplexní rezonance se středem při δ (1H) = 0,0 ppm. Pokud jde o jejich amorfní povrchovou vrstvu, strukturní molekuly vody a kyselé fosfátové druhy přítomné v neapatitickém prostředí jsou pozorovatelné ve formě jediné rezonance soustředěné na δ (1H) = 5.2 ppm a široká rezonance v rozmezí od δ(1H) = 7 do 17 ppm32.
za Druhé, tento experiment umožňuje vyšetřování 1H-zjištěna CP dynamics selektivně odhalit povahu 1H jader v okolí 31P jádra. Za tímto účelem byla doba kontaktu 1 (tCP1) udržována pevně na 1000 µs, zatímco doba kontaktu 2 (tCP2) se pohybovala od 75 µs do 1000 µs (obr. 2). Jednotné zvýšení magnetizace je pozorován u obou rezonancí soustředěn na δ(1H) = 0.0 a δ(1H) = 5.2 ppm (černé přerušované čáry), dříve připisované OH− ionty a strukturální H2O molekuly podle jejich 1H NMR chemický posun. V kontrastu, vývoj široký signál v rozmezí δ(1H) = 7-17 ppm zpočátku ukazuje rychlý nárůst jeho magnetizace (až tCP2 = 300 µs) a následuje přítomnost oscilační chování (až tCP2 = 1250 µs – viz černá přerušovaná čára). Toto oscilační chování je charakteristické pro dipolární oscilace 1H-31P (DP-H) 55, 56. Montáž odpovídajících {1H-31P}1h ssnmr spekter na různých tCP2 není přímočará kvůli překrývání různých rezonancí. Zatímco syntetické vzorky HA obvykle vykazují symetrickou OH-rezonanci32; ukážeme zde, že OH− rezonance, kostní minerál je obzvlášť složité a mohou být namontována následujícím způsobem: a hlavní vrchol v δ(1H) = 0.0 ppm obklopen dvěma rameny vrcholy v δ(1H) = -0.7 a 0,9 ppm (Obr. Galaxie). Zbytková strukturální rezonance vody může být správně vybavena jediným vrcholem se středem při δ (1H) = 5,2 ppm (obr. S4). V kontrastu, široké signál z kyselých fosfátů druhů pozorovatelná v rozmezí δ(1H) = 7-17 ppm, nemůže být uspokojivě vybaveny, jediný vrchol, s pevnou pozici a šířku čáry, a to zejména v krátkých kontaktních časech (nejlépe padnoucí výsledky pro různé tCP2 hodnoty v Obr. S4-levý sloupec). Výsledky montáže jsou však přesné, pokud se používají dva různé píky s pevnými polohami a pevnými šířkami vedení (6,2 ± 0,1 a 5,0 ± 0,1 ppm) (obr. S4-pravý sloupec). Nemůžeme tvrdit, že tento široký signál je pouze složen ze dvou píků odpovídajících dva odlišné protonové prostředí, ale to je pravděpodobně skládá z široké distribuce chemických prostředích, což vede k rozdělení NMR chemických posunů. Podle Toho Obr. 3A ukazuje čtyři vrcholy, které byly použity k analýze 31P-filtruje 1H ssNMR spektra kostních minerálů pro každý tCP2 hodnoty: (i) kompozitní vrchol se středem v δ(1H) = 0.0 (fialová) a jeden vrchol se středem v δ(1H) = 5.2 (šedá) ppm obou vyznačuje relativně pomalý a rovnoměrný růst jejich magnetizations; a (ii) dvou vrcholů u δ(1H) = 9.8 (modrá) a 14.0 (zelená) ppm zobrazení dipolárních oscilací (Obr. 3B). Pokud jde o tyto poslední dva vrcholy, přesná shoda profilu Hartmann-Hahn (H-H) (obr. S2) umožňuje numerické modelování CP build-up křivky podle jednoho spinu dvojice modelu účetnictví pro dipolárních oscilace vyplývající z koherentní polarizace přenos a dopad 1H spin diffusion57:
Kvantifikace HPO4 2− iontů v minerální kostní
kvantifikace HPO42− ionty přítomné v kostní minerální byly provedeny. Za tímto účelem, lineshape a tloušťku čáry z jednotlivých 31P NMR signály OH− a PO43–obsahující vnitřní krystalické jádro a H2O a HPO42–obsahující non-apatitic prostředí (amorfní povrchové vrstvy), které byly odhaleny v Obr. 4B, byly použity při montáži kvantitativního spektra MAS ssNMR s jedním impulsem 31P čerstvého 2letého vzorku ovčí kostní tkáně (obr. 5A). Bylo zjištěno, že molární procentní podíl iontů hpo42− a PO43− v kostním minerálu je asi 50/50 ± 5%. Jak naznačují naše pozorování na obr. S9 a S10, tento výpočet byl proveden za předpokladu, že molární podíl iontů hpo42 ve vnitřním krystalickém jádru částic byl blízko 0%. Tak vysoký molární podíl HPO42− ionty přítomné v amorfní povrchové vrstvy odráží malé velikosti kostní minerální částice: ∼1-5 nm v tloušťce ∼10-40 nm na šířku, a ∼20-100 nm v length1,61,62,63. Protože jsme ukázali, že ionty HPO42 jsou koncentrovány v amorfní povrchové vrstvě, můžeme nyní odhadnout průměrnou tloušťku této vrstvy pro 2letý vzorek ovčí kostní tkáně. Zde uvažujeme nanosized destiček o tloušťce 4,0 nm, a budeme předpokládat, že hustota vápenatý atomy, přítomné v hydroxyapatitu je krystalové mřížky a v amorfní povrchové vrstvy jsou rovnocenné. V takovém případě je tloušťka vnitřního krystalického jádra asi 2,4 nm (tj., což je asi dvakrát velikost hexagonální jednotkové buňky hydroxyapatite64 podél krystalografické osy a, b; a = b = 0.94 nm), zatímco tloušťka vnějšího amorfní povrchové vrstvy, lze odhadnout na cca 0,8 nm (tj., které pak odpovídá velikosti hexagonální jednotkové buňky hydroxyapatitu podél a, b, a, proto, je ekvivalentní k stohování pouze dvě fosfátové ionty). Je třeba si uvědomit, že se jedná o průměrné hodnoty, které odpovídají součtu příspěvků všech anorganických fosfátových iontů přítomných v našem 2letém vzorku ovčí kostní tkáně. Tyto výsledky se mohou lišit u starších vzorků, ve kterých by podíl neapatitických prostředí mohl být menší 65 kvůli zrání kostních minerálů: progresivní transformace amorfní povrchové vrstvy na apatická prostředí15. Nicméně, tloušťka povrchové vrstvy určuje zde (0,8 nm) je v dobré shodě s předpokládanou velikostí navržených v některé předchozí studie: o velikost jedné fosfátové jednotky v fluorapatite-želatina mesocrystals66; a o 1-2 nm v syntetické hydroxyapatites32,67,68.
Aktualizovat na kostní minerální chemické složení
výsledky jsou zde prezentovány a elsewhere45 naznačují, že průměrné chemické složení zralé kortikální kostní minerální navržené Legros et al.27, Ca8. 3□1,7(PO4) 4.3 (HPO4 nebo CO3)1.7 (OH nebo ½ CO3) 0,3□1.7 musí být znovu zváženo. Opravdu, tento vzorec není jen ignorovat přítomnost amorfní povrchové vrstvy, jejichž chemické složení se výrazně liší s ohledem na apatitic prostředí přítomny ve vnitřní krystalické jádro částice, ale také podceňuje molární podíl HPO42− ionty. Navrhnout aktuální vzorec našeho 2letého vzorku ovčí kostní tkáně, nejprve jsme potřebovali určit hmotnostní podíl CO32-iontů. Hodnota 4,8% s významným podílem v uhličitanech typu B byla zjištěna pomocí analýz FT-IR49 (obr. 5B), což je v souladu s hodnotami zjištěnými pro jiné vzorky kostních minerálů3. Kromě toho, tyto parametry byly považovány: (i) částice musí zůstat elektricky neutrální (jak vnitřní krystalické jádro a amorfní povrchové vrstvy); (ii) molární podíl HPO42− iontů ve vztahu k celkovému množství anorganických fosfátových iontů je omezen téměř 50% podle této studie; (iii) stupeň sycení by měla být blízko k experimentální hodnota (4.8% w/w); (iv) celkový Ca/(P + C) molární poměr by měl zůstat přijatelné pro kostní tkáně vzorku, jsem.e. v rozmezí 1,2-1,53 a naposledy (v) Podíl iontů a-typu, B-typu a neapatitických uhličitanů přítomných v amorfní povrchové vrstvě by měl zůstat v souladu s údaji FT-IR. Jakmile všechny tyto omezení byly sloučeny, průměrné chemické složení zralé kortikální kostní minerální z naší 2-leté ovce kostní tkáně vzorku lze aproximovat takto: Ca7.5(PO4)2.8(HPO4)2.6(CO3)0.6(OH)0,2. Je třeba poznamenat, že toto průměrné chemické složení odpovídá pouze našemu specifickému vzorku kostní tkáně podle našich vlastních experimentálních výsledků. Proto tento vzorec není univerzální, protože variabilita se vyskytuje u vzorků kostí v závislosti zejména na druhu, věku, zásobování potravinami a jejich stupni zrání.