Úvod

Familiární Více Lipomatózou (FML, OMIM% 151,900) je vzácné autosomálně dominantní porucha podkoží, vyznačující se tím vývojem no-zapouzdřené podkožní uzlíky na končetinách a trupu.1 První zprávy o více adipocytárních nádorech byly provedeny od roku 1846 sirem Benjaminem Brodiem.2 Novější výsledky z Blaschko (1891), a Alsberg (1892) prokázaly familiární recidivy léze a pozorován zvýšený výskyt u mužů.1,3,4 V následujících letech, mnoho dalších autorů, publikované rodiny s vlastnostmi vysoce sugestivní FML,1,5,6 a konečně v roce 1970 Das Gupta klasifikovány lipomatous nádorů ve třech kategoriích: solitérní nebo sporadické, FML a Více Symetrické Lipomatózou (MSL).7,8

solitární lipomy jsou považovány za nejčastější benigní novotvar měkkých tkání u dospělých, ale mnohočetné lipomy se vyskytují u 5% jedinců.9,10 přesná prevalence FML není známa, ale odhaduje se na 0,002%.8,11,12 Věk-nástup uzliny je mezi 30 a 40 let, dosáhl maximální vrchol v 50.letech.6,8,13,14 To bylo široce rozhodl, že touto poruchou vykazují preference pro muže, nicméně, velké množství prací prokázat, že obě pohlaví jsou stejně postižených.15-17 ačkoli je to považováno za benigní onemocnění, u některých jedinců se mohou objevit kosmetické obavy, což zhoršuje jejich kvalitu života. Navíc je také převládající u obézních jedinců.9

až dosud byl dostupný výzkum v FML výslovně zaměřen na klinické aspekty a molekulární problémy obvykle nejsou zkoumány. Literatura naznačuje, že alespoň 70% sporadických lipomy výsledek z cytogenetické přestavby zahrnující 12q13-15 kapela, která by mohla vést k deregulaci exprese HMGA2 (High Mobility Group AT-hook 2) gen. Tento gen kóduje nehistonové chromatinové proteiny zodpovědné za konformační změny DNA, aberantní buněčnou proliferaci a vývoj benigních mezenchymálních nádorů.18-20

rozpoznání molekulární základny genetických podmínek a implementace vysoce výkonných sekvenačních technologií umožnilo prozkoumat a objasnit další mechanismy zapojené do etiologie několika genodermatóz. Cílem této studie bylo proto provést klinickou a molekulární charakterizaci sedmi jedinců s FML k detekci variant v šesti kandidátských genech souvisejících s lipomatózou pomocí technik Sanger a sekvenování nové generace (NGS).

Materiály a Metody

Pacientů a Etické Aspekty

Tento výzkum byl proveden v souladu s principy Helsinské Deklarace. Schválení bylo získáno od institucionální kontrolní komise před studiem (Etická komise pro výzkum na FCM-UNICAMP, soubor č. 1.313.164) a všichni účastníci dali písemný informovaný souhlas. Studii jsme provedli na ambulanci služby lékařské genetiky v klinické nemocnici University of Campinas (HC-UNICAMP) v São Paulu v Brazílii. Celkem sedm jedinců patřících do pěti nesouvisejících rodin (pojmenovaných od A do E) bylo způsobilé. Primární zařazení kritéria pro výběr subjektů bylo následující: i) věk nad 18 let, ii) klinická a histopatologická diagnóza lipoma nebo angiolipoma a iii) familiární opakování naznačuje autosomálně dominantní dědičnost. Hlavní klinické aspekty byly získány z lékařských záznamů pomocí strukturované formy. Fyzické hodnocení zahrnovalo účast jak dermatologů, tak genetiků. Patologické oddělení v HC-UNICAMPU poskytlo histopatologické vzorky. Klinické nálezy jsou podrobně popsány v tabulce 1.

Tabulka 1 Shrnutí Klinických Pacientů s FML

Sanger Sekvenování Genu HMGA2

Genomová DNA byla extrahována z periferních EDTA krevní vzorky ze sedmi pacientů podle tradiční fenol-chloroform postup používaný Sambrook et al21

polymerázová řetězová reakce (PCR) byla provedena k zesílení pět coding exons a intron-exon křižovatek regionech HMGA2 gen. Pomocí dvou on-line bioinformatická nástroje, Primer3 (https://primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm), a OligoAnalyer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer), jsme navrhli konkrétní pár primerů jsou shrnuty v Tabulce 2.

Table 2 Specific Primers of the HMGA2 Gene for PCR

PCR products were verified on a 12% polyacrylamide gel and then purified directly with Illustra ExoStar™ (GE Healthcare Life Sciences). All selected exons were sequenced on an automatic capillary system, ABI3500xL DNA analyzer (BigDye® Terminator Cycle Sequencing kit v3.1, Life Technologies®) podle pokynů výrobce. Chromatogramy byly zkoumány pomocí Chromas v. 2. 6. 5. Výsledky byly porovnány s HMGA2 Ensembl transkript number ENST00000403681 (https://grch37.ensembl.org/index.html). Zkontrolovali jsme románu varianty ve třech veřejných datových souborů: i) Globální Aliance pro Genomiku a Zdraví (GA4GH) Beacon network (https://beacon-network.org/#/), ii) Exome Agregace Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) a, iii) Online Archiv Brazilské Mutace (http://abraom.ib.usp.br/). K hodnocení patogenity výsledky a efekty poškození nových variant v kandidátských genu HMGA2, jsme používali různé in silico predikční modely jako VEP (Varianta Účinek Prediktor),22 FATHMM (Funkční Analýzy Prostřednictvím Skryté Markovovy Modely),23 UMD-prediktor,24 SIFT (Sorting Netolerantní z Tolerantní),25 PROVEAN (Protein Variace Efekt Analyzer),26 a Mutace Ochutnávka.27.

Target Multi-Gen Panel

vlastní panel byla provedena pro posouzení geny zapojené v syndromový lipomatózou. K provedení této techniky jsme získali genomickou DNA ze vzorků slin pěti pacientů (A, B, C, D A E) pomocí sady pro vlastní sběr DNA ORAGENE® (DNA Genotek, Inc., Ottawa, Ontario, Kanada). Vzorky byly poté obohaceny a hybridizovány proti cílovým specifickým sekvencím. Zachycení bylo provedeno pomocí sekvenceru Illumina® MiSeq (TruSeq Capture) nové generace v párovém režimu 150bp podle standardního protokolu pro tuto platformu. Hloubka pokrytí cílových oblastí byla vyšší než 50x. obohacení a analýza byly zaměřeny na kódovací sekvence pěti transkriptů (AKT1 NM_005163.2, APC NM_000038.5, MŮŽI1 NM_130799.2, PIK3CA NM_006218.2, a PTEN NM_000314.4), 10bp z intronic sekvencí a dalších regionech pravděpodobně původce onemocnění. V průběhu šetření byly rovněž zváženy exonické delece, duplikace a variace v místě spojení. Čtení byla zarovnána a porovnána s referencí lidského genomu (GRCh37). Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) byl vybrán k ověření variant jak je uvedeno v Invitae® Corporation (1400 16th Street, San Francisco, CA 94103, #).

Dostupnost Dat

Sekvence byly předloženy GenBank (přístupové číslo: BankIt2217069 Seq1 -MK875826). Datové soubory týkající se tohoto článku jsou k dispozici na European Bioinformatics Institute EMBL-EBI přes ENA úložiště s studie přistoupení číslo PRJEB28960 (https://www.ebi.ac.uk/ena).

výsledky

klinická analýza

bylo zahrnuto sedm jedinců z pěti nesouvisejících rodin (A, B1, B2, C, D1, D2 a E), jak je znázorněno na obrázku 1. Nezjistili jsme rodičovskou příbuznost mezi účastníky. Etnický původ byl uváděn jako smíšený každým probandem. V obecném přehledu bylo pozorováno, že rodiny a A B mají tři po sobě jdoucí nebo více generací. Poměr pohlaví mužů a žen byl odhadnut v poměru 1: 6. Průměrný věk při zařazení byl 42 let (SD 11,8), zatímco průměrný věk nástupu lézí byl 28 let (SD 11,8). Ženy hlásily nejvyšší výskyt uzlů po těhotenství. Klasické klinické rysy FML zahrnovaly měkké uzliny vysoce variabilní co do počtu a velikosti, umístěné v podkožním tuku a omezené na kmen a končetiny, jak je znázorněno na obrázku 2. Nepohodlí a výrazná citlivost na palpaci byly zaznamenány pouze u jednotlivých a. komorbidní gastrointestinální poruchy byly přítomny u pacientů A, C a D2. Hlásili divertikulitidu a polypy, těžkou chronickou zácpu a kolorektální karcinom. Čtyři pacienti měli histologické hodnocení subkutánních lézí. Přítomnost zralých tukových buněk zaoblené četné kapiláry potvrdil angiolipoma diagnostické, jako odkazuje Bancroft a Fletcher et al10,28 (viz Obrázek 2). Další relevantní zjištění jsou popsána v tabulce 1.

Obrázek 1 Přehled rodokmenů rodin, studoval (A–E). Všimněte si, jak jsou ženy a muži stejně zapojeni, a autozomálně dominantní dědičný vzor s ovlivněnými téměř dvěma po sobě jdoucími generacemi. Rodina A měla nejvyšší počet generací vyvíjejících mnohočetné lipomy (a). Proband A (III 2) byl jediný v její rodinné skupině a v kazuistice při odkazování na bolest, když byl vyšetřen (a). Šipky označují probands.

Obrázek 2 Klinické charakteristiky FML a histopatologické aspekty lipomy (ON skvrna (10×). Mezi primární nálezy patří měkké, pohyblivé a bezbolestné uzliny umístěné v podkožním tuku. Nejběžnější topografické rozdělení zahrnuje horní končetiny (A, B A D), přední břišní stěnu, záda a stehna (C). Lipom obvykle představuje lobulovaný vzor bílých adipocytů s jednotnými jádry a tenkou vláknitou kapslí (E). Angiolipomy se skládají ze zralého tuku ve spojení s četnými malými krevními cévami, které jsou převážně kapiláry. Fibrinové tromby (šipky) jsou velmi časté (F). Obrázky s laskavým svolením Katedry patologie A Lékařské Genetiky, School of Medical Sciences, UNICAMP.

Molekulární

Sanger sekvenování odhalilo dvě nové varianty v exonu 5 genu HMGA2. Obě varianty byly identifikovány u pacienta A A B1. První byla synonymem heterozygotní varianta c.327C>T p.(Asp=) považován za nízký dopad nebo neutrální, založené na několika předpověď nástroje (VEP, FATHMM, UMD-prediktor, PROSÍT, PROVEAN). Naproti tomu, druhá změna byl nesmysl měnit heterozygotní varianta c.328T>C (p.*110Glnext*16), který způsobuje stop kodonu nahrazení glutamin aminokyselina a následné rozšíření konečného proteinu (https://www.hgvs.org/mutnomen/recs-prot.html). Obrázek 3 schematizuje strukturu genu HMGA2, domény vázající proteiny, a nové varianty.

Obrázek 3 Struktura lidského genu HMGA2. (A) lokalizovaný na 12q14.3, Gen HMGA2 pokrývá více než 140 kb a zahrnuje pět exonů. Exon 1, 2 a 3 (modré boxy) kódují doménu AT-hook (modré kruhy). Čtvrtý exon (lilac) kóduje pro distanční oblast. Exon 5 (růžový box)kóduje C-terminální doménu proteinu 109 aminokyselin. B) Elektroferogram od pacientů A, B1 a reference. U těchto pacientů byly nalezeny dvě identické nové varianty. Je synonymem heterozygotní varianta c.327C>T (p.Asp=) a ne zastavit, změnit heterozygotní varianta c.328T>C (p.*110Glnext*16).

varianta c.328T>C (p.*110Glnext*16) byla definována jako 100% patogenní nebo vysoký dopad podle uvedených in silico algoritmy. Nicméně, mutace degustátor predikce systém prokázal rozpor mezi dvěma variantami popsaných, jak je znázorněno v tabulce 3. Cílené multi-gen panel AKT1, APC, MUŽI-1, PIK3CA, PTEN v rodinách A, B, C, D, a E, ani detekovat škodlivé změny v posloupnosti hodnocena.

Tabulka 3 Varianty Nalezené v Jedinci a a B1 a Srovnání Mezi Predikční Nástroje,

Diskuse

aktuální studie bylo identifikovat molekulární základy FML prostřednictvím integrace moderních technik sekvencování jako Sanger sekvenování a NGS v kombinaci s tradiční klinické přístupy.

V návaznosti na předchozí studie ukazuje současný výzkum určité rozdíly týkající se epidemiologických údajů. Zjistili jsme, že existuje běžná mylná představa o klasifikaci a diagnostice různých typů lipomatózy.7,10,15 Několik autoři zdůrazňují, že muži mají vysokou tendenci prezentovat více lipomy,11,29,30 nicméně, naše výsledky ukazují zřejmou vysokou frekvenci FML u žen. Je možné, že toto zjištění pouze odráží zkreslení výběru kvůli malé velikosti vzorku, nebo může být také vysvětleno skutečností, že ženy častěji vyhledávají zdravotní lékařskou péči kvůli kosmetickým obavám.31 Nicméně, údaje ukazují, že podíl postižených jedinců u obou pohlaví byl podobný, což vede k sexuální poměr blízko k 1:1 (10 mužů vs 13 žen), které mohou podceňovat skutečné prevalence FML.6,8,16 je Zajímavé, že celkový počet lipomy poznamenal, u žen byla vyšší v porovnání s unikátní mužský zkoumal.1,14

Faktory jako je nadváha a obnovený růst konkrecí během a po těhotenství naznačují, že exogenní faktory (dieta), metabolické změny (dyslipidemie nebo změny ve mastných kyselin desaturace) a hormonální mechanismy mohou být zapojeny do adipocytů hyperplazie.32,33 Yee et al porovnání rozdíly v enzymatické desaturace z stearoyl-CoA mezi jedinci s vzácnými tukové poruchy (RAD) a obézní skupiny kontrolní, a dospěl k závěru, že jedinci s FML a obezitou ukázala, že nejvyšší míra desaturace, čímž se zvyšuje lipogenezí proces.32,34

Jeden nečekané bylo zjištění, že pacient byl pouze v casuistic a její rodinné skupiny projevovat bolest, denní slabost, únava, a psychiatrické komorbidity (chronická deprese a úzkostné poruchy). Tyto příznaky jsou silně spojeny s Dercumovou chorobou, která je považována za diferenciální diagnózu nebo variantu FML.35 na Základě nových Dercum Onemocnění klasifikace navržené Hansson et al,36 identifikovali jsme u tohoto pacienta zobecněné nodulární forma, charakterizována intenzivní bolest na povrchu tukové tkáně a kolem lipomy. Další studie, která podporuje tuto hypotézu byl publikován Campen et al37 popsali rodinu devět členů s diagnózou mnohočetné lipomy, který zobrazí proměnné příznaků se pohybovala od celkového postižení asymptomatické uzliny. Lze tedy předpokládat, že segregace sleduje autozomálně dominantní vzorec s proměnlivou expresivitou a případně představuje extrémní projev FML.

O histopatologické diagnózy, jsme o tom svědčí dva hlavní typy: lipom a angiolipoma. Mikroskopicky je nejčastějším znatelným znakem angiolipomu proliferace jemných krevních cév, které obsahují fibrinové mikrotromby ve spojení se zralými adipocyty.Zdá se, že 10,28 Angiolipomů má vysoký výskyt u mladých dospělých mužů, kteří občas projevují mírnou bolest nebo citlivost. Tento typ nádoru souvisí také s anamnézou lokálního traumatu nebo s použitím steroidní terapie.13,38 i když mnozí autoři uznávají obě diagnózy jako různé patologické entity, některé zprávy není tento rozdíl vzhledem k velmi jemné rozdíly mezi nimi.39 V tomto kontextu naše analýza potvrzuje, že je možné mít angiolipomas s familiární opakování a této diagnózy by mohly být součástí široké spektrum FML.40-43 kromě toho byly v několika rodinách hlášeny také lipomy s více vřetenovými buňkami, jiný typ lipomu.44

ačkoli existuje několik studií zaměřených na expresi a přímou cytogenetickou analýzu sporadických lipomů, jen málo studií bylo znepokojeno ústavními příčinami FML.2 rozsáhlé řady lipomů u dospělých potvrzují mnohočetné strukturální přeskupení s frekvencemi v rozmezí od 50 do 75%.10,28,45 mezi těmito vyváženými chromozomálními změnami je translokace t (3; 12) (q27-28; q13-15) pozorována u téměř 25% nádorů.9 ve většině případů zarážka ovlivňuje Gen HMGA2, který se skládá z 5 exonů a generuje protein 109 aminokyselin (obrázek 3).18,46,47 Ligon et al hlásil případ osmiletého chlapce s ústavním přeskupením ovlivňujícím pásmo 12q14. 3 (de novo pericentrická inverze), zahrnující Gen HMGA2. Nicméně, klinický fenotyp charakterizován somatickou přerůstání, rozvoj kostní a zubní věk, mozečku nádor, a více lipomy,48 liší od našich casuistic.

analyzovali Jsme heterozygotní varianty c.327C>T p.(Asp=) a c.328T>C (p.*110Glnext*16) exon 5 genu HMGA2 v různých predikčních programů. Synonymní nebo tichá změna byla interpretována jako benigní, zatímco změna translačního stop kodonu byla považována za 100% patogenní nebo vysoký dopad. Tímto způsobem, to může znamenat, že změny zahrnující 3ʹ UTR (untranslated) region by vyvolat neoplastickou transformaci genu HMGA2.49 Fusco et al zdůraznili klíčovou roli genu HMGA2 v mezenchymálních nádorech. Oni navrhli, že v genu HMGA2, 3ʹ UTR regionu je obecně umlčen Let-7 miRNA a jakékoliv změny na této úrovni, a to buď zkrácení nebo fusion s mimoděložní sekvence, disky k její up-regulaci, a tudíž abnormální množení buněk.46

je poněkud překvapivé, že v rodině B jsme zjistili obě nové varianty pouze u matky (B1). Mohlo by to znamenat, že se nesegregují s fenotypem FML a jsou vyřazeny alespoň v této rodině jako etiologická příčina. Na druhé straně pacient a představil stejné dvě nové varianty, ale prokázal fenotyp vysoce naznačující Dercumovu chorobu. Navzdory těmto slibným zjištěním je poněkud obtížné je interpretovat, protože nebylo možné posoudit další příbuzné postižené FML.

fokální infiltrace tuků a mnohočetné lipomy mohou být přítomny u několika syndromů. Proteus syndrom a HŘEBÍČEK (Vrozené Lipomatous asymetrické Přerůstání, Cévní malformace, Epidermální névy, kostí a páteře anomálie) jsou příklady somatických mutací, kde lipomatózou je přítomen.50,51 Na druhou stranu, Bannayan-Riley-Rubacalva Syndrom, Mnohočetné Endokrinní Neoplázie typu 1, Cowden syndrom a Gardner syndrom jsou podmínky vyplývající z germline mutace, které mají souběžně lipomatózou.52-55 i některé mutace zahrnující mitochondriální funkci souvisejí s abnormálním růstem tukové tkáně většinou v horní části trupu a krku a nejlepším příkladem je Madelungova choroba.56 negativní panel AKT1, APC, MEN-1, PIK3CA a PTEN však vylučuje, že jsou zodpovědní za fenotyp FML, alespoň v tomto výzkumu.

Závěr

FML je vzácné a heterogenní onemocnění, které se může překrývat s jinými dermatologické syndromy, jako jsou Dercum Onemocnění. Přirozená historie FML v této sérii odhalila, že vývoj lézí byl progresivní a dosáhl svého nejvyššího výskytu u jedinců středního věku. FML ovlivnila obě pohlaví a představovala topografické rozložení s převahou v končetinách a kmeni. Poměr pohlaví mezi hodnocenými pacienty vykazoval prevalenci žen, ale údaje o rodokmenu vykazovaly vyváženější distribuci. Diagnóza Dercumovy choroby byla také rozpoznána u jednoho jedince (pacienta a).

molekulární přístup poskytl hlubší vhled do genetického základu FML a pokusil se důkladně vyšetřit co největší počet kandidátních genů s ní spojených. Jsme zdůraznili užitečnost NGS kromě Sanger metoda v chápání celé spektrum FML, v důsledku by to mohlo nabídnout alternativu pro etiologii identifikaci a charakterizaci vzácných genetických onemocnění v klinické nastavení. Varianty v exonu 5 genu HMGA2 nebyly popsány a dosud mají nejistý význam v genezi FML. Další studie, včetně více značný počet postižených jedinců a funkční analýzu románu variant HGMA2 genu, by měla být provedena k určení jeho biologické funkce v FML lepší.