ÚVOD

Halophiles jsou zajímavou skupinou organismů prosperující na vysoké slanosti. Tyto organismy mohou být široce klasifikovány na základě jejich optimální slanost vody pro růst do mírné halophiles (1-6%, w/v NaCl), středně halophiles (7-15%) a extrémní halophiles (15-30%) (Madigan a Martinko, 2006). Rozsáhlý výzkum ukázal, že halophiles nejsou omezeny pouze na některou z oblastí života, mohou být eukaryot (Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar et al., 2005), nebo prokaryoty patřící do domén bakterií a Archaea. Řas rodu Dunaliella a žábronožky Artemia (Boetius a nebo joye, 2009) jsou příklady halofilních eukaryot, vzhledem k tomu, Halobacterium a Salinibacter jsou příklady halofilních prokaryot. Úspěch halophiles v přežití ve vysoce slaném prostředí je vzhledem k jedinečné fyziologické adaptace, jako ion čerpání strategie a organických rozpuštěných látek akumulace (Oren, 2006; Madigan a Martinko, 2006). Na genomické a proteomic úrovně, halophiles se vyznačují vysokou GC obsahu a bílkovin, vyznačující se tím, nízká hydrofobicita, přes zastoupení kyselých zbytků, nižší sklony helix tvorbu a vyšší sklony cívky struktura (Paul et al., 2008).

Halophiles jsou nyní získávají větší přístup k průmyslové mikrobiologie a biotechnologie protože halophiles růst při vysoké koncentraci soli a tím se minimalizuje riziko kontaminace během kultivace (Oren, 2006). Několik příkladů biotechnologických aplikací je použití Micrococcus varians vyrábět nuclease H (Kamekura el al., 1982) a využití halofilních Tetragenococcus kmenů při výrobě sojové omáčky a produkci některých enzymů, včetně hydroláz (amyláz, nukleázami, fosfatáz a proteáz) (Oren, 2006). Halophiles jsou také důležité v biodegradace a bioremediace protože mnoho halophiles jsou schopny rozkládat uhlovodíky a jiné toxické sloučeniny (Ventosa et al., 1998). Halophiles může také produkovat polymery používají jako boostery, oleje zotavení, protože jejich povrchově aktivní činnost a bioemulsifying vlastnosti (Oren, 2006).

Halophiles vzkvétat v prostředí, kde slanost dosahuje vysoké úrovně, jako jsou oceány, sluneční salterns a přírodních solných jezer (Oren, 2007). Mrtvé moře Jordánsko je jedním z největších opravdu hypersaline vnitrozemských slaných jezer na světě (Boetius a nebo joye, 2009; Oren, 2007; Madigan a Martinko, 2006). Kromě vysoké slanosti; soli, koncentrace více než 340 g L-1 (Oren, 2007), Mrtvé moře je jedinečné svou vysokou barometrický tlak (800 mmHg) vzhledem k velmi nízké nadmořské výšce pod hladinou moře, parciální tlak kyslíku (PIO2) o 8% více než na úrovni moře, unikátní UV záření, nízká vlhkost (pod 40%) a nedostatek deště (Avriel et al., 2011).

tato studie byla provedena za účelem klasifikace halofilních heterotrofních bakteriálních druhů prosperujících v přímořské zóně Jordánského Mrtvého moře. Mikrobiální klasifikace je založena na koloniální a buněčné morfologii, stejně jako podobnost v 16S rRNA genu.

materiály a metody

vzorkování: vzorky vody z Mrtvého moře byly odebrány ze čtyř přímořských zón (obr. 1) v březnu, červnu a říjnu 2011. Zeměpisné souřadnice a nadmořská výška míst odběru vzorků jsou uvedeny v tabulce 1. Zeměpisné souřadnice a nadmořská výška byly určeny pro každé místo (eTrex Legend C, Tchaj-wan). Voda z mrtvého Moře vzorky byly odebrány v 1 L čisté sterilní skleněné láhve ponechat dostatek prostoru hlavy v láhvi a transportován ihned do laboratoře.

fyzikálně-chemická analýza vzorků: Byla stanovena teplota, pH, celkové rozpuštěné pevné látky (TDS) a biologická potřeba kyslíku (BOD) vzorků vody. Teplota vody, pH a slanost byly měřeny in situ. Teplota vody a pH byly měřeny přenosným pH metrem (mikropočítač pH meter T19000, Trans Instruments). Slanost byla měřena ručním refraktometrem salinity. BOD byl měřen v (voda, Životní prostředí a vyprahlé regiony výzkumné centrum Na Al al-Bayt University, Jordánsko). Vzorky vody byly přeneseny do nové skleněné láhve, poté bylo přidáno 1 mL fosfátového pufru, síranu hořečnatého, chloridu vápenatého, roztoků chloridu železa na litr vzorku vody. Vzorek byl poté přiveden na teplotu 20±3°C a nasycen filtrovaným vzduchem bez organických látek. Bylo zkontrolováno pH vzorku. Pokud byl vzorek není v rozmezí 6.5-7.5, kyseliny sírové nebo hydroxidu sodného byl přidán vzorek do požadované oblasti pH (6.5-7.5) a na přidané koncentraci ani ředit vzorek více než 0,5%. Vzorek byl před provedením ředění přiveden na teplotu 20°C. Vhodný objem vzorku byl poté přenesen do lahví BOD. Láhev byla naplněna dostatečným množstvím ředicí vody, aby vytlačila veškerý vzduch a nezanechala žádné bubliny. Rozpuštěný kyslík (DO) byl stanoven pomocí analyzátoru DO a veškerý přemístěný obsah byl pevně nahrazen ředicí vodou a zátkou. Láhev byla inkubována po dobu 5 dnů při teplotě 20°C. poté byl stanoven DO A BOD byl vypočítán podle rozdílu mezi počátečním a konečným DO nad objemem.

Obohacení, izolace a gram barvení: Pro obohacení vzorků vody byla voda z Mrtvého moře (10 mL) přenesena do 90 mL kapalného média s vysokou slaností a inkubována při 30°C ve tmě za třepání (100 ot / min). Po asi 12 h, loopful obohacení kultury byl melír na modifikovaných pevných minerálních solí střední a oddělené kolonie byly pak subcultured. Glycerolové zásoby izolátů byly také připraveny a skladovány při -20°C pro další analýzu. Buňky byly Gram-obarveny a zkoumány pod mikroskopem.

16S sekvenování a analýza genů rRNA: amplifikace a sekvenování genů rRNA 16S byla provedena společností Macrogen Inc., Soul, Korea, podle následující metody: mladé kolonie bakteriálních kmenů byly suspendovány v 1,5 mL centrifugační zkumavky obsahující 0,5 mL sterilního fyziologického roztoku a poté centrifugována při 10 000 ot / min po dobu 10 min, supernatant byl odstraněn a sediment byl suspendován v 0,5 mL InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA) a inkubovány při 56°C po dobu 30 min a pak se zahřeje na 100°C po dobu 10 min. Po zahřátí byl supernatant použit pro PCR. PCR byla provedena smícháním 1 µL templátové DNA s 20 µL reakčního roztoku PCR. 27F / 1492R primery (27F: 5’ – AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′, 1492R: 5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG AKT T-3’) byly použity pro zesílení a pak 35 amplifikačních cyklů byly provedeny při 94°C po 45 sec, 55°C po dobu 60 sec a 72°C po dobu 60 sec. Neregistrovaným PCR primery a dntp byly odstraněny z PCR produktů pomocí Montage PCR Clean up kit (Millipore). Purifikované produkty PCR přibližně 1400 bp byly sekvenovány primery 518F/800R (518F: 5’ – CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’ – TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). Sekvenování bylo provedeno pomocí Big Dye terminator cycle sequencing kit v. 3.1 (Applied BioSystems, USA). Sekvenační produkty byly vyřešeny na automatizovaném dna sekvenačním systému Applied Biosystems model 3730XL (Applied BioSystems, USA) v Macrogen, Inc., Soul, Korea.

sekvence byly analyzovány a porovnány s veřejnou databází nukleotidů pomocí webové stránky NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Sekvence nejbližších příbuzných byly poté načteny z databáze a použity k vytvoření fylogenetického stromu pomocí MEGA5 (Tamura et al., 2011). Obsah GC sekvence byly vypočteny pomocí kalkulačky Oligo (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

výsledky

fyzikálně-chemické vlastnosti vzorků: Vzorky vody z Mrtvého moře byly velmi solné v rozmezí od (36-38%). Hodnoty pH vzorků byly nízké a pohybovaly se v rozmezí od 5,6 do 6,3. To naznačuje mírně kyselou vlastnost mořské vody. Hodnota BOD byla velmi nízká (1-2 mg O2 L-1), což naznačuje velmi nízký obsah organického materiálu ve vzorku. Fyzikálně-chemické vlastnosti jsou uvedeny v tabulce 2.

Heterotrofní životaschopné bakteriální počet: Výsledky životaschopných mikroorganismů odhalily velmi nízký počet kolonie tvořících jednotek v každém vzorku (200-6000 CFU mL-1). Počet CFU je uveden podrobněji v tabulce 3.

izolace a klasifikace halofilních heterotrofních bakterií: v této studii jsme izolovali 44 halofilních heterotrofních bakteriálních kmenů. Jedenáct bakteriálních kmenů ze 44 bylo považováno za odlišné na základě koloniální morfologie, gramové barvení a morfologie buněk. Sedm z jedenácti různých kmenů bylo grampozitivních a 4 ze 7 byly gramnegativní. Bakteriální kmeny byly identifikovány na základě analýzy genu rRNA 16S a bylo zjištěno, že patří do domény bakterií. Nejbližší příbuzný každého izolovaného bakteriálního kmene je uveden v tabulce 4 a obr. 2. Všechny sekvence vykazovaly relativně vysoký obsah GC (až 58%).

DISKUSE

fyzikálně-chemické vlastnosti vody Mrtvého moře vzorky byly stanoveny a analyzovány. Bylo zjištěno, že procento slanosti je velmi vysoké (až 38%). Jedná se o typickou charakteristiku vody z Mrtvého moře, což z ní činí jednu ze slavných solanek “ athalassohaline „(Oren, 2007). Bylo zjištěno, že pH vody z Mrtvého moře je mírně kyselé (5,6-6,3)ve srovnání s pH (7,5-8) v thalassohalinových solankách (Oren, 2007). BOD vzorků byly velmi nízké (1-2 mg O2 L-1) odrážející nízký organický materiál ve vodě, který by mohl být využit heterotrofními bakteriemi. Tyto fyzikálně-chemické podmínky nepochybně negativně ovlivňují mikrobiální rozmanitost. Proto byl počet životaschopných buněk v testovaných vzorcích velmi nízký (ne více než 6×102 CFU mL-1) ve srovnání s otevřenou mořskou vodou. Počty heterotrofních bakterií v mořských vodách jsou obvykle v řádu 105 až 106 bakterií mL-1 (Zweifel a Hagstromová, 1995; Madigan a Martinko, 2006). Tato čísla jsou odvozeny od nespecifické fluorescenční barvení techniky (Zweifel a Hagstromová, 1995), které se obvykle dává vyšší čísla než životaschopných mikroorganismů metodou. První publikace o počtu bakterií v Mrtvém moři byly provedeny mikroskopií. Číslo buňky bylo asi 1.9×106 buněk mL1 a během květu červených halobakterií dosáhla hustota populace 1, 9×107, ale po můrách klesla na 5×106 (Oren, 1983).

výzkum halofilních organismů obývajících Mrtvé moře začal velmi brzy v roce 1892, kdy byly bakterie izolovány z rodu Clostridium z bahna (Oren, 2002). Později, v krátkém článku, který vyšel v roce 1936, dal první popis původní mikrobiální společenství přizpůsobit extrémně tvrdým podmínkám Mrtvého moře (Oren a Ventosa, 1999). Od té doby se naše znalosti o biologických aspektech Mrtvého moře rozšiřují a hromadí. Tento výzkum jsme provedli, abychom rozšířili naše znalosti o halofilních heterotrofních bakteriích prosperujících v přímořské zóně Jordánského Mrtvého moře. Izolovali jsme různé bakteriální druhy. Následně jsme izolovali a identifikovali 11 různých druhů halofilních bakterií. Většina izolátů byla grampozitivní (7 z 11). Přestože grampozitivní bakterie mají důležité úpravy, umožňují jim převrat s environmentálním stresem, jako je vysoká slanost (Battistuzzi a Hedges, 2009). V literatuře není jasné, zda grampozitivní bakterie nebo gramnegativní bakterie jsou dominantní v hypersalinovém prostředí. V jedné studii na prokaryotické halophiles zotavil ze sedimentů z mělké El-Djerid solné jezero v Tunisku, Hedi et al. (2009) zjistil, že dominantní bakteriální populace patří k grampozitivním bakteriím tvořícím spory.

všechny izolované kmeny v této studii patří do domény bakterií. Patří do 7 různých rodů v doméně. Pět ze sedmi grampozitivních bakteriálních izolátů patří do rodu Bacillus. Tento rod byl založen v roce 1872, aby zahrnoval tři druhy, ale nyní je v Bergeyho manuálu systematické Bakteriologie uvedeno 142 pojmenovaných druhů bacilů (Logan a de Vos, 2009). Kmeny bacilů jsou typicky půdní kmeny. Kmeny Bacillus izolované v této studii patří k následujícím druhům B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis a B. cereus. Tyto kmeny se vyskytovaly v různých slaných prostředích (Miranda et al., 2008; Parvathi a kol., 2009; Yoon a kol., 2004; Al-ZaZaee a kol., 2011). Například B. licheniformis byl dříve získán z mořských sedimentů Mirandou et al. (2008), zatímco B. pumilus byl izolován z mořských organismů, jako jsou ústřice, kraby a ryby, kromě sedimentů Parvathi et al. (2009). B. hwajinpoensis byl získán z mořské vody východního moře a Žlutého moře v Koreji (Yoon et al ., 2004). A konečně B. cereus, běžná půdní bakterie, se setkala v odpadních vodách, ale s halofilními vlastnostmi (Al-ZaZaee et al ., 2011). Tlusté buněčné stěny, vysoké peptidoglykanu, obsah (více než 90% buněčné stěny) (Madigan a Martinko, 2006), vysoké GC obsahu a odolné-spore tvoření jsou hlavní důvody pro Bacillus přežití v drsných podmínkách, jako je vysoká salinita. Je třeba poznamenat, že kmen DSD32 (identifikovaný jako B. cereus)má velmi nízkou podobnost se svým nejbližším příbuzným B. cereus. Tento kmen může představovat nový druh rodu Bacillus založený na genu rRNA 16S.

další dvě grampozitivní bakterie jsou kmeny Arthrobacter sp. a kocuria rosea. Druhy Arthrobacter jsou v přírodě široce rozšířeny, zejména v půdě (Funke et al ., 1996), ale v hypersalinových prostředích není příliš běžný. Kocuria rosea je považována za mírně halofilních druhů a byla vrácena z různých prostředí, jako je solný roztok otevřené mělké vody a některé kmeny Kocuria rosea roste optimálně na koncentraci NaCl ve výši 30% (Wright a Tanaka, 2002).

gramnegativní bakterie byly v našich vzorcích méně časté (4 z 11). Publikovaná literatura však ukazuje, že tyto izoláty nejsou ve slaném prostředí neobvyklé. Jeden z izolovaných kmenů byl identifikován jako Vibrio alginolyticus. Druhý druh je ve skutečnosti běžný v mořských vzorcích (Molitoris et al., 1985) a byl nalezen v mořské mořské vodě. Kmen má lékařský význam, protože může způsobit komplikovanou infekci kůže a měkkých tkání (Sganga et al ., 2009). Ještě důležitější je, některé kmeny Vibrio alginolyticus bylo zjištěno, že vyrábět tetrodotoxin, silný neurotoxin (Noguchi et al., 1987). Další gramnegativní bakterií identifikovanou v této studii je Chromohalobacter salexigens. Tento druh byl poprvé izolován a popsán jako mírně halofilních druhů Halomonas elongata a pak navrhla jako nový druh Chromohalobacter (Arahal et al., 2001). Erythrobacter gaetbuli je další druh identifikovaný v této studii. Tento kmen také není neobvyklý pro slaná stanoviště. Nedávno byl izolován z přílivového bytu Žlutého moře v Koreji a Yoon et al byl popsán jako Halofilní druh. (2005). Poslední kmen patří Salinivibrio costicola. Tento druh byl poprvé popsán jako Vibrio costicola ale jeho fenotypové a genotypové vlastnosti ji odlišit od druhů rodu Vibrio. Proto byl kmen zařazen do nového samostatného rodu salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola je mírně halofilních a byl původně izolován z solené jídlo a rostou optimálně v médiu obsahujícím 10% soli (Mellado et al., 1996). Člen rodu Salinibacter, s. ruber, je zajímavým modelem pro studium adaptace mikroorganismů na život při vysokých koncentracích solí (Oren, 2007).

ZÁVĚR

Mrtvé Moře vody z litorální zóny se vyznačuje vysokou slanost, nízké pH, nízká organického materiálu obsah (nízká BSK) a omezit různých druhů heterotrofních bakterií, které patří jak Gram-pozitivní a Gram-negativní rodů včetně Arthrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Chromohalobacter, Bacillus a Erythrobacter.

POTVRZENÍ

Tato studie byla podpořena deanship akademického výzkumu na Al al-Bayt University, Jordánsko, rozhodnutí Vědecké Rady v zasedací číslo 2/2010/2011. Autor by tak rád ocenil finanční pomoc poskytovanou univerzitou.