ZÁKLADNÍ A TRANSLAČNÍ UROLOGIE

Experimentální model lidské corpus cavernosum, relaxace hladkého svalstva

Rommel P. RegadasI; Maria. E. a. MoraesII; Francisco J. C. MesquitaI; Joao B. G. CerqueiraI; Lucio F. Gonzaga-SilvaI

IDepartment Chirurgie, School of Medicine, Federální Univerzity v Ceará, Fortaleza, Ceara, Brazílie
IIDepartment Farmakologie, School of Medicine, Federální Univerzity v Ceará, Fortaleza, Ceara, Brazílie

Korespondence

ABSTRAKT

Účelem: Popsat techniku pro en bloc sklizeň corpus cavernosum, kavernózní tepny a trubice z transplantace, dárci orgánů a kontrakce-relaxace experimenty s corpus cavernosum hladké svaloviny.
materiály a metody: corpus cavernosum byl rozřezán do bodu připojení k penisu crus. Segment 3 cm (corpus cavernosum a urethra) byl izolován a umístěn do ledově studeného sterilního transportního pufru. Při zvětšení byla rozříznuta kavernózní tepna. Tak byly získány 2 cm fragmenty kavernózní tepny a corpus cavernosum. Pásy o rozměrech 3 x 3 x 8 mm3 byly potom namontovány svisle do izolovaného zařízení pro varhany. Kontrakce byly měřeny izometricky s Narko-Biosystems platnost posunu snímače (model F-60, Narko-Biosystems, Houston, TX, USA) a jsou zaznamenány na 4-kanálový Narko-Biosystems psací stůl model detektoru lži.
výsledky: fenylefrin (1µM)byl použit k indukci tonických kontrakcí v corpus cavernosum (napětí 3-5 g) a kavernózní tepně (napětí 0,5-1 g) až do dosažení plošiny. Po předkontrakci byly použity relaxanty hladkého svalstva k vytvoření křivek relaxační odezvy (10-12M až 10-4 M). Nitroprusid sodný byl použit jako relaxační kontrola.
Závěr: sklízecí technika a hladké svalové kontrakce-relaxace model popsaný v této studii bylo prokázáno, že být užitečné nástroje při hledání nových léků pro léčbu lidských erektilní dysfunkce.

Klíčová slova: penis; kavernózní tepny; erekci; experimentální; erektilní dysfunkce:

ÚVOD

Erektilní dysfunkce (ED) postihuje přibližně 150 milionů lidí na celém světě. Prevalence ED v Brazílii je vysoká: více než 40% brazilských mužů ve věku 40 až 70 let trpí ED a více než milion nových případů je každoročně registrováno 1,2.

i když fosfodiesterázy typu 5 (PDE-5 inhibitory) revoluci v léčbě erektilní dysfunkce, mnoho pacientů, hlavně těch s endoteliální dysfunkcí (56% případů), nemají prospěch z této formy terapie 3.

V současné době mnohé studie jsou prováděny pomocí oxidu dusnatého (NO) dárci, guanylyl cyklázy aktivátory (jak rozpustné intracelulární a membránu vázané izoformy), iontový kanál agonisty a RhoA-kinázy inhibitory s cílem formulovat nové léky s různými mechanismy účinku k léčbě této populace pacientů 4,5.

drtivá většina těchto studií používá potkan a králík corpus cavernosum kvůli obtížím při získávání vzorků lidské tkáně 5-7. V naší urologické službě však od roku 2004 probíhají experimentální studie ED s použitím tkáně lidského corpus cavernosum od dárců orgánů.

účelem této studie bylo poskytnout podrobný popis techniky používané pro en bloc sklizeň corpus cavernosum, kavernózní tepny a močové trubice transplantace dárci orgánů a metody kontrakce-relaxace experimenty s corpus cavernosum hladké svaloviny.

MATERIÁLY A METODY,

Všechny studijní protokoly byly již dříve schváleny Lidských Subjektů Výzkumu Etická komise Federální Univerzity v Ceará a Národní Výzkumné Etické komise Brazilské Ministerstvo Zdravotnictví.

po povolení rodiny bylo lidské corpus cavernosum získáno od dárců mrtvol (< 40 let) během operace transplantace orgánů.

Po odstranění srdce, jater a ledvin a přes stejný řez (xiphoid stydké), corpus cavernosum byl umístěn nad stydké kosti digitální injekční přístup. Corpus cavernosum byl rozřezán do bodu připojení k ischiopubickému ramusu (crus penis) (Obrázek-1).

3 cm segmentu včetně corpus cavernosum a močové trubice byl izolován en bloc (Obrázek-2). Na konci procedury nebyl proveden žádný další vnější řez. Následně tkání byly umístěny v ledové sterilní dopravy pufru (Collins řešení) a zpracovaná do 1 hodiny po odběru.

vzorky byly zpracovány za stereoskopického zvětšení. Celá kavernózní tepna ve středu corpus cavernosum byla odříznuta a izolována od okolních kavernózních tkání(obrázek-3). Pak byly kavernózní tkáně odděleny od pojivových tkání a tunica albuginea. Tak byly získány 2 cm fragmenty každé kavernózní tepny a corpus cavernosum.

corpus cavernosum fragmenty byly nakrájíme na proužky o rozměrech přibližně 3 x 3 x 8 mm3 a svisle pod 1g klidové napětí. Kavernózní tepna byla rozřezána na 5 mm kroužky a namontována vodorovně pod 0,2 g klidového napětí. Tkáně byly udržovány v 5 mL orgánů komory obsahující Krebs-Henseleit střední skládá 114,6 mM NaCl, 4.96 mM KCl, 1,3 mM MgSO4, 2.0 mM CaCl2, 1.23 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3 a 3.6 mM glukózy, obohacený s 10 µM guanetidin a 10 µM indometacin (pH 7.4, 37 ° C, do plynu s 5% CO2 a 95% O2).

tkáně byly ponechány v rovnováze po dobu 90 minut s promýváním v 15minutových intervalech. Napětí bylo měřeno izometrickým převodníkem (F-60 Narco-Biosystems připojeným k 4kanálovému stolnímu modelu polygrafu) (obrázek-4).

do lázní byl přidán jeden mikromol fenylefrin, aby se dosáhlo 60-70% submaximálních kontrakcí hladkého svalstva. Následně křivky závislosti koncentrace-odezva (10-8M do 10-2 M) hladké-svalová relaxancia nebo nitroprusidu sodného (SNP), oxidu dusnatého dárce, byly vyneseny zkontrolovat endoteliální funkční integrity.

VÝSLEDKY

Fenylefrin (1 µm) byl použit k vyvolání tonikum kontrakce v corpus cavernosum (3 – 5g napětí) a kavernózní tepny (0.5 – 1g napětí) až do dosažení plató. Po předkontrakci byly použity relaxanty hladkého svalstva k vytvoření křivek relaxační odezvy (10-12M až 10-4 M). SNP byl použit jako relaxační kontrola.

v naší laboratoři bylo použito množství chemických látek k navození relaxace hladkého svalstva, včetně RuC13, dárce oxidu dusnatého. Zcela uvolňuje lidský corpus cavernosum a kavernózní tepnu a dosahuje Emax 100% a EC50 6,4 ± 0,14 (obrázek-5).

Pomocí přípravků z corpus cavernosum s intaktní endotel od lidských dárců za 40 s ne historie erektilní dysfunkce a kardiovaskulárních rizikových faktorů (např. diabetes, hypertenze a dyslipidemias), tento physio-farmakologický model se ukázal být atraktivní nástroj při hledání nových léků pro léčbu lidských erektilní dysfunkce.

inhibitory PDE-5 způsobily revoluci v léčbě erektilní dysfunkce. Mnoho pacientů s ED však také trpí endoteliální dysfunkcí (56%), a proto nereagují na tuto třídu léků 3.

endoteliální dysfunkce je často pozorována u pacientů s komorbiditami, jako je arteriální hypertenze a diabetes mellitus. Je charakterizován nedostatkem endogenní produkce č. 8.

v pravém ED, diabetes, hypertenze a dyslipidemie (složky metabolického syndromu) mají tendenci být spojeny s endoteliální dysfunkcí. Bylo také hlášeno, že ED je markerem kardiovaskulárního arteriálního onemocnění 9.

hledání nových léků schopných zvýšit dostupnost endogenního NO bylo značnou výzvou. V posledních desetiletích bylo použito několik experimentálních modelů založených na krysách, králících a lidském corpus cavernosum 6,7,10,11.

použití corpus cavernosum in vivo a dalších tkání (např. krevních destiček)od druhů, jako jsou krysy, králíci a lidé, Peng Wang et al. 12 dospěl k závěru, že navzdory podobné kinetice a enzymatickým vlastnostem mají různé PDE různou citlivost na inhibitory. To je třeba vzít v úvahu při práci s experimentálními modely tohoto typu.

Náš experimentální model zaměstnané zdravé corpus cavernosum tkání z mladé mrtvoly dárců zabit trauma nebo cévní mozkové příhody s cílem minimalizovat obavy o zkreslení výsledků způsobené vzorku tkáně špatném stavu.

V kontrastu, ve studii, za použití podobné lidské corpus cavernosum, model pro hodnocení účinku sildenafilu na enzymatické inhibice PDE a následné relaxace hladkého svalstva, vzorky byly získány od pacientů s ED při operaci implantace penilní protézy, takže se zdá pravděpodobné, že v tomto případě většina předmětů prezentovány endoteliální zranění do určité míry 6.

dalším problémem v této oblasti výzkumu je dostupnost tkání k provádění experimentů. V Ceará se každý měsíc provádí osm transplantací orgánů, což umožňuje dokončit studie bez větších přerušení.

Seidler et al. 4 pracoval na podobném modelu s použitím corpus cavernosum darovaného pacienty podstupujícími operaci změny pohlaví jako léčbu transsexualismu a poruchy genderové identity. A to i přes dobrý stav tkání, malý počet mužů předložit tento typ řízení omezuje možnost sbírat dostatek tkáně pro experimentální práci.

tento článek představuje ucelený model pro odběr tkání lidského corpus cavernosum a pro provádění experimentů relaxace hladkého svalstva in vivo. Zdravý lidský corpus cavernosum je odstraněn z mrtvol dárců a podroben experimentům v izolovaných lázních. Tato technika umožňuje pitvat a izolovat corpus cavernosum, kavernózní tepnu a močovou trubici.

význam této techniky spočívá v tom, že to dělá to možné testovat celou řadu nových léků, včetně stabilní donorů, guanylyl cyklázy aktivátory a RhoA-kinázy inhibitory, na hladké svaloviny corpus cavernosum, tepen penisu a močové trubice 7,12-15.

ZÁVĚR

Tento experimentální model zahrnuje pitva, sklizeň, izolace a uchování lidské corpus cavernosum, kavernózní tepny a močové trubice za ideálních podmínek spolu s průvodním physio-farmakologické studie. Proveditelnost a reprodukovatelnost modelu z něj činí atraktivní nástroj při hledání nových léků pro léčbu lidské erektilní dysfunkce.

střet zájmů

Žádný deklarován.

1. Moreira ED Jr, Bestane WJ, Bartolo EB, Fittipaldi JA: Prevalence a determinanty erektilní dysfunkce v Santosu v jihovýchodní Brazílii. Sao Paulo Med J. 2002; 120: 49-54.

2. Moreira ED Jr, Lisboa Lôbo CF, Villa M, Nicolosi a, Glasser DB: Prevalence a korelace erektilní dysfunkce v Salvadoru v severovýchodní Brazílii: populační studie. Int J Impot Res. 2002; 14 (Suppl 2): S3-9.

3. Feldman HA, Goldstein I, Hatzichristou DG, Krane RJ, McKinlay JB: Impotence a jeho zdravotní a psychosociální koreláty: výsledky Massachusetts Male Aging Study. J Urola. 1994; 151: 54-61.

4. Seidler M, Uckert S, Waldkirch E, Stief CG, Oelke M, Tsikas D, et al.: In vitro účinky nové třídy látek darujících oxid dusnatý (NO) na izolovanou lidskou erektilní tkáň. Eur Urol. 2002; 42: 523-8.

5. Lopes LFG, Wieraszko AY, El-Sherif, Clarke MJ: D-translabilizace oxidu dusnatého v komplexech Ru-II imidazoly vázanými na C. Inorg-Chim Acta 2001; 312: 15-22.

6. Ballard SA, Gingell CJ, Tang K, Turner LA, Cena MI Naylor AM: Účinky sildenafilu na uvolnění lidské corpus cavernosum tkáně in vitro a na činnosti, cyklických nukleotidů izoenzymy fosfodiesterázy. J Urola. 1998; 159: 2164-71.

7. Prieto D, Rivera L, Recio P, Rubio JL, Hernández M, García-Sacristán A: Role oxidu dusnatého v relaxaci vyvolané sildenafilem v tepnách rezistence penisu. J Urola. 2006; 175: 1164-70.

8. Rendell MS, Rajfer J, Wicker PA, Smith MD: Sildenafil pro léčbu erektilní dysfunkce u mužů s diabetem: randomizovaná kontrolovaná studie. Sildenafil Diabetes Studijní Skupina. Jamo. 1999; 281: 421-6.

9. Palumbo PJ: metabolické rizikové faktory, endoteliální dysfunkce a erektilní dysfunkce u mužů s diabetem. Jsem Med Sci. 2007; 334: 466-80.

10. Thompson CS, Mumtaz FH, Khan MA, Wallis RM, Michailidis DP, Morgan RJ, et al.: Účinek sildenafilu na relaxaci hladkého svalstva kavernózního těla a tvorbu cyklického GMP u diabetického králíka. Eur J Pharmacol. 2001; 425: 57-64.

11. Angulo J, Cuevas P, Moncada I, Martín-Morales A, Allona A, Fernández A et al.: Zdůvodnění kombinace PGE (1) a s-nitroso-glutathionu k navození relaxace hladkého svalstva lidského penisu. Jaromír Jágr. 2000; 295: 586-93.

12. Wang P, Wu P, Myers JG, Stamford A, Egan RW, Billah MM: charakterizace fosfodiesteráz lidského, psího a králičího corpus cavernosum typu 5. Life Sci. 2001; 68: 1977-87.

13. Martinez AC, García-Sacristán A, Rivera L, Benedito S: dvoufázová odpověď na histamin v dorzální tepně králíka penisu. Jaromír Jágr. 2000; 36: 737-43.

14. Matsumoto a, Morita T, Kondo S: erekce penisu zprostředkovaná alfa-adrenoceptory u psů: pozorování in vivo a in vitro. J Hladké Svalstvo Res. 2000; 36: 169-79.

15. Andersson KE, Gratzke C: farmakologie antagonistů alfa1-adrenoceptorů v dolních močových cestách a centrálním nervovém systému. Nat Clin Pract Urol. 2007; 4: 368-78.

Korespondence
Dr. Rommel Prata Regadas
Dr. Ratisbona, 208, Fatima
Fortaleza, Ceará, 60411-220, Brazílie
Fax: + 55 85 3366-8064
E-mail: [email protected]

Přijato po revizi: leden 20, 2010,

KOMENTÁŘ

Penilní erekce je komplexní neurovaskulární události, která se spoléhá na vazodilataci erektilní tkáně v důsledku neuronální a endoteliální odvozen dusnatého (no), vydané aktivace parasympatické nervy na sexuální stimulaci kavernózní endotelových 1.

Tento sexuální stimul přináší průtok krve do corpus cavernosum a následné penilní rigiditu je udržována prostřednictvím venookluzivního mechanismu.

to umožňuje konkrétní mikroarchitektura corpus cavernosum, která souhlasí s sofistikovaným hemodynamickým systémem.

jinak hraje tunica albuginea klíčovou roli v erektilní funkci.

Být bohatý na elastická vlákna je schopen odolávat přetěžování korpusu na zvýšené hladiny intrakavernózní tlak, stlačení trans-albugineal odpadních vod žíly, stejně poskytování na neroztažitelným ochranné konstrukce na arteriole a intrakavernózní nervy.

Tato funkce je možné díky jeho struktuře z collagenic vlákna spojeny elastické vlákno mosty 2,3

Proto je velmi důležité udržet svou integritu udržet svou zásadní roli v mechanismu erektilní.

přítomnost strukturálních poruch, jako je nadměrné ukládání kolagenu vede k tvorbě plaku, fibrotické a pak kalcifikované, jako lze nalézt v Peyronieho choroby.

kromě toho dochází k významnému snížení koncentrace elastických vláken také u těchto pacientů postižených indurací penis plastica 4.

Podobná změna byla nalezena u pacientů, kteří podstoupili radikální prostatektomii, kde trabekulární elastická vlákna a hladká svalová vlákna, byly sníženy a obsahu kolagenu byla významně zvýšena 5.

Jako věk pokroky gonadální steroidní hormony, a zejména testosteronu produkce klesá, 6, nervové vodivosti se zpomaluje a účinnost cévní mikrocirkulaci penisu je snížena.

Androgeny jsou nezbytné pro vývoj, růst a zrání erektilní tkáně, které působí na hemostatis v kavernózních tělesech, regulující růst hladkého svalstva a syntézu bílkovin pojivové tkáně.

proto by snížení jejich produkce mohlo vést k přechodu z elastických vláken na kolagenová vlákna, která je základem kavernózní fibrózy 7,8.

nedávné studie ukázaly, že testosteron také reguluje expresi fosfodiesterázy typu 5 (PDE5) 9.

je známo, že erektilní dysfunkce (ED) postihuje 150 milionů lidí na celém světě.

ještě před několika lety se předpokládalo, že 90% ED má psychogenetickou etiologii.

Navíc, další neurofyziologické, hemodynamical a farmakologické studie nám pomohly lépe pochopit složité biochemické a mikro-anatomické mechanismus erektilní funkce, nám ukazuje, že 50% ED má organické etiologie 10.

na druhé straně by i psychogenetický ED mohl být důsledkem zvýšení adrenergní stimulace a samotného organického původu 11.

posledních 20 let bylo svědkem pozoruhodných změn v léčbě ED.

vznik a úspěch PDE5 inhibitory jako efektivní terapii erektilní dysfunkce je pozoruhodné vzhledem k záměru za vývojem původní sloučenina: původně navržen jako antianginózní agent, rychle se ukázalo, že první PDE5 inhibitor na trhu, sildenafil, zobrazí erectogenesis jako vedlejší účinek, a lék byl brzy rozpoznán jako potenciální revoluční léčbu ED.

Dále bylo prokázáno, že sildenafil zabraňuje progresi fibrózy corpus cavernosum u prostatektomizovaných pacientů. Zdá se, že jeho účinnost je výsledkem antiproliferačního účinku působícího na fibroblasty 12.

je známo, že inhibitory PDE-5 způsobily revoluci v léčbě erektilní dysfunkce a změnily život milionů lidí na celém světě.

stále však existuje vysoké procento pacientů s ED, kteří jsou také postiženi endoteliální dysfunkcí (56%) a následně nereagují na tuto třídu léků 13.

ačkoli již byly rozsáhle studovány, žádní dárci nejsou nadále důležitým tématem, pokud jde o ED.

Mnohé studie byly provedeny k nalezení nových donorů nebo nové guanylyl cyklázy aktivátory pokusit se najít nové léky k léčbě těchto pacientů, kteří jsou non-respondérů na PDE-5 inhibitory 14.

tato práce nám ukazuje model pro sběr tkání lidského corpus cavernosum a pro provádění experimentů relaxace hladkého svalstva in vivo.

zdravé corpus cavernosum odebrané od mladých dárců mrtvol zabitých traumatem nebo mrtvicí nabízí tkáně v dobrém stavu.

v literatuře jsme nenalezli podobný přístup kvůli obtížnosti získání vzorků lidských tkání.

S touto technikou je možné testovat nové léky, jako ŽÁDNÝ dárců, guanylyl cyklázy aktivátory a Roja-Kinázy inhibitory na lidské hladké svalové tkáně in vivo spíše pak pomocí corpus cavernosum in vivo ze zvířat, jako jsou krysy nebo králíci, jak to bylo provedeno tím, že Pero Wang et al. 15.

konečně, tato technika sklizně a model kontrakce a relaxace hladkého svalstva by mohl být velmi užitečným nástrojem, který nám pomůže najít nové léky k léčbě ED.

1. Andersson KE, Wagner G: fyziologie erekce penisu. Physiol Rev. 1995; 75: 191-236.

2. Iacono F, Barra S, de Rosa G, Boscaino, Lotti T: Mikrostrukturní poruchy tunica albuginea u pacientů postižených impotence. Eur Urol. 1994; 26: 233-9.

3. Iacono F, Barra S, Lotti T: koncentrace elastických vláken v tunica albuginea corpora cavernosa a noční sledování tumescence. Int J Impot Res. 1995; 7: 63-70.

4. Iacono F, Barra S, De Rosa G, Boscaino A, Lotti T: Mikrostrukturální poruchy tunica albuginea u pacientů postižených Peyronieho chorobou s dysfunkcí erekce nebo bez ní. J Urola. 1993; 150: 1806-9.

5. Iacono F, Giannella R, Somma P, Manno G, Fusco F, Mirone V: histologické změny v kavernózní tkáni po radikální prostatektomii. J Urola. 2005; 173: 1673-6.

6. Traish A, Kim N: fyziologická role androgenů v erekci penisu: regulace struktury a funkce corpus cavernosum. J Sex Med. 2005; 2: 759-70.

7. Traish AM, Guay AT: jsou androgeny kritické pro erekci penisu u lidí? Zkoumání klinických a preklinických důkazů. J Sex Med. 2006; 3: 382-404; diskuse 404-7.

8. Park K, Seo JJ, Kang HK, Ryu SB, Kim HJ, Jeong GW: nový potenciál funkční MRI závislé na úrovni okysličení krve (BOLD) pro hodnocení mozkových center erekce penisu. Int J Impot Res. 2001; 13: 73-81.

9. Morelli A, Filippi S, Mancina R, Luconi M, Vignozzi L, Marini M, et al.: Androgeny regulují expresi fosfodiesterázy typu 5 a funkční aktivitu v corpora cavernosa. Endokrinologie. 2004; 145: 2253-63. Erratum v: Endokrinologie. 2004; 145: 3152.

10. Kaiser FE: erektilní dysfunkce u stárnoucího muže. Med Clin North Am. 1999; 83: 1267-78.

11. Iacono F, Barra S, Lotti T: hodnocení penilních hlubokých tepen v psychogenní impotenci pomocí duplexní ultrasonografie. J Urola. 1993; 149: 1262-4.

12. Iacono F, Prezioso D, Somma P, Chierchia S, Galasso R, Micheli P: Histopatologicky prokázána prevence prostatektomii kavernózní fibróza se sildenafilem. Urol Int. 2008; 80: 249-52.

13. Feldman HA, Goldstein I, Hatzichristou DG, Krane RJ, McKinlay JB: Impotence a její lékařské a psychosociální koreláty: výsledky studie stárnutí mužů v Massachusetts. J Urola. 1994; 151: 54-61.

14. Seidler M, Uckert S, Waldkirch E, Stief CG, Oelke M, Tsikas D, et al.: In vitro účinky nové třídy látek darujících oxid dusnatý (NO) na izolovanou lidskou erektilní tkáň. Eur Urol. 2002; 42: 523-8.

15. Wang P, Wu P, Myers JG, Stamford A, Egan RW, Billah MM: charakterizace fosfodiesteráz lidského, psího a králičího corpus cavernosum typu 5. Life Sci. 2001; 68: 1977-87.