| mag vs resolution | working distance | monocular parts | care of the microscopes |
| monocular focusing | oil immersion | measuring field diameter | binocular parts | binocular focusing | PDF version| Microscopy Exercises |

A. Úvod

typická sloučenina světelný mikroskop (Obr.1) je schopen zvýšit naši schopnost vidět detaily 1000krát, takže lze vidět objekty malé jako 0,1 mikrometru (um) nebo 100 nanometrů (nm). Elektronové mikroskopy rozšiřují tento rozsah dále, což nám umožňuje vidět objekty tak malé jako 0,5 nm v průměru nebo zhruba 1/200 000 th velikosti, kterou můžeme vidět pouhým okem. Netřeba dodávat, že vývoj a používání mikroskopů výrazně zlepšilo naše chápání buněk a jejich struktury a funkce.

Obrázek 1. Binokulární složený mikroskop.

B. Zvětšení, Rozlišení a Pracovní Vzdálenost.

Zvětšení je prostě funkci objektu se zobrazí větší, jako když jsme se použít ruční objektiv pro zvětšení tištěného slova. Pouhé zvětšení objektu bez současného zvýšení množství viděných detailů neposkytne divákovi dobrý obraz. Schopnost mikroskopu (nebo oka) vidět detail je funkcí jeho rozlišovací schopnosti. Rozlišovací schopnost je definována jako minimální vzdálenost mezi dvěma objekty, na které objekty mohou být jen rozlišit jako samostatný a je funkcí vlnové délce použitého světla a kvalita optiky. Obecně platí, že čím kratší je vlnová délka světelného zdroje, tím vyšší je rozlišení mikroskopu.

Pracovní vzdálenost je vzdálenost mezi objektivem a vzorkem. Při nízkém zvětšení je pracovní vzdálenost relativně dlouhá. Jak zvýšíte zvětšení pracovní vzdálenost dramaticky klesá. Olejové ponorné čočky se pacticky dotýkají vzorku. Uvědomte si tuto změnu pracovní vzdálenosti se zvyšujícím se zvětšením, abyste zabránili poškození vašich vzorků.

začátek stránky

C. části monokulárního složeného světelného mikroskopu:

věnujte prosím čas seznámení se s mikroskopem a jeho správným používáním. Ovládací prvky dvou značek mikroskopů, které používáme v našich kurzech, jsou uvedeny níže (obr. 2).

Obrázek 2. Ovládání binokulárních mikroskopů Leica a Olympus.

1. Oční čočka nebo okulár: naše jsou 10x zvětšení. Obory, které použijeme, jsou monokulární (pouze jeden okulár.)

2. Tělesná trubice: obsahuje zrcadla a hranoly, které nasměrují obraz na oční čočku.

3. Nosepiece: drží objektivy, otáčí se, zaznamenává pozitivní zarážky pro každý objektiv.

4. Objektivy: obvykle 3-4 na našich oborech, 4x, 10x, 43x, 100x ponoření do oleje (červené pruhy). Celkové zvětšení = oční výkon x objektivní výkon.

5. Fáze: plošina, na které jsou namontovány diapozitivy pro prohlížení; některé obory mají mechanické stupně. Naučte se, jak snímek správně oříznout.

6. Membrána: membrána řídí množství světla, které prochází do vzorku a může drasticky ovlivnit zaostření obrazu. NAUČTE SE POUŽÍVAT MEMBRÁNU CO NEJRYCHLEJI. VĚTŠINA PROBLÉMŮ, KTERÉ BUDETE MÍT ZAOSTŘENÍ, BUDE ZPŮSOBENA NESPRÁVNÝM NASTAVENÍM SVĚTLA.

máme dva typy:

• clona clony: hledejte páku těsně pod pódiem poblíž přední strany.
• typ číselníku: těsně pod jevištěm je otočný číselník s různými otvory (otvory); tento typ je užitečný pro vytvoření efektu pseudo tmavého pole.

7. Zaostřovací knoflíky: umístěné na straně mikroskopu; nejvzdálenější je jemné zaostření a nejvnitřnější je hrubé zaostření.
8. Světelný zdroj: naše obory mají zabudované světelné zdroje. Tlačítkový spínač je umístěn (nejčastěji) za světelnou čočkou na základně.

začátek stránky

d. Péče a Zacházení s kombinovaným Mikroskopem

Existuje jen málo ABSOLUTNÍ pravidla dodržovat v péči o mikroskopy, které budete používat. Postaráno, tyto nástroje budou trvat mnoho desetiletí a budou i nadále dobře fungovat. Jakékoli poruchy prosím neprodleně nahlaste svému instruktorovi.

1. K přenášení rozsahu vždy používejte dvě ruce-jednu na paži a druhou pod základnou-žádné výjimky! Nikdy nenoste rozsah vzhůru nohama, pro oční plechovku a vypadne.

2. K čištění všech čoček před každou laboratorní relací a po použití čočky pro ponoření oleje použijte papír objektivu. NIKDY, NE TEĎ, NIKDY NEPOUŽÍVEJTE K ČIŠTĚNÍ ČOČEK NIC JINÉHO NEŽ PAPÍR NA ČOČKY. Ostatní papíry jsou příliš nečisté a poškrábají optický povlak na čočkách. Při čištění čoček také nepoužívejte žádné kapaliny-pouze papír na čočky!

3. Vždy používat správné technika se zaměřením na vyhnout se těsnění na objektivu do snímku – to může zlomit objektivu a/nebo zničit drahý snímek.

4. Vždy vypněte světlo, když nepoužíváte rozsah.

5. Drát vždy opatrně umístěte z cesty. Dráty smyčkované v prostorech nohou vyvolávají velkou katastrofu mikroskopu. Zkuste posunout drát dolů přes úchyty zásuvky bside lavici prostor.

6. Při odkládání vždy nasaďte kryt mikroskopu

horní část stránky

E. postup zaostřování: monokulární mikroskopy

1. Zapněte světelný zdroj.

2. Přepněte na objektiv 10x.

3. Ustupte na hrubé zaostření a zvedněte kus nosu.

4. Umístěte sklíčko vzorku na jeviště a zajistěte jej ve správné poloze. Podívejte se na snímek a umístěte jej tak, aby vzorek byl nad světelnou clonou ve fázi.

5. Dolní objektiv objektivu na spodní hranici (v blízkosti snímku). Zvedněte objektiv pomocí knoflíku hrubého zaostření, dokud neuvidíte zaostření obrazu, a poté znovu zhasněte, pak zaostřete zpět, dokud nenajdete středové zaostření. Upravte jemné zaostření podobně.

6. Vycentrujte obraz a upravte světlo pomocí membrány.

7. Recenter a upravte zaostření, nejprve hrubé, pak jemné zaostření jako v kroku 5.

8. Podle potřeby upravte membránu.

9. Nyní přepněte cíle na 43x, pokud je potřeba vyšší zvětšení. Podle potřeby upravte jemné zaostření a světlo (membránu).

Naše obory jsou parfocal což znamená, že při přepnutí z nízké (100x) na vysoké (430x) síla, soustředěný obraz při nízkém výkonu zůstávají více či méně v zaměření na vyšší výkon. S největší pravděpodobností budete muset mírně upravit jemné zaostření a bránici.

začátek stránky

F. postup ponoření oleje

na některých našich monokulárních a všech binokulárních složených mikroskopech máme 100x čočky pro ponoření oleje. Ty lze identifikovat červeným pruhem kolem pouzdra čočky. Na zvětšení větší než asi 500x světlo láme moc, jak prochází vzduch výnos dobrou rozlišovací schopností. Optika pro tato vyšší zvětšení se tedy používá s vysoce kvalitním minerálním olejem jako médiem pro přenos světla. Je bezpodmínečně nutné používat pouze ponorný olej a po každém použití důkladně vyčistit čočku papírem na čočky.

1. Vyhledejte oblast zájmu na snímku a vycentrujte ji na 430x.

2. Zvedněte objektivovou čočku na její hranici (tj., maximalizujte vzdálenost mezi jevištěm a cíli) a otočte čočku z cesty asi v polovině cesty do další polohy.

3. Opatrně umístěte malou kapku ponorného oleje přímo na sklíčko přes střed oblasti zájmu.

4. Otáčejte objektivem ponoření oleje do polohy a při pohledu ze strany jej opatrně spouštějte pomocí knoflíku hrubého zaostření, dokud se objektiv nedotkne kapky oleje. Uvidíte, že kapka vyskočí do sloupce při navázání kontaktu.

5. Snížit objektiv smidgen více a pak, pomocí jemného zaostření a při pohledu přes oční čočky, zaměřit se na vzorku.

6. Po dokončení čistěte čočku papírem na čočky, dokud se nevypustí žádný olej, a vyčistěte sklíčko, pokud má být uloženo.

začátek stránky

G. Určení Pole-of-View Průměr

možná Budete chtít, aby odhadnout velikost vzorků (např. buněk), uvidíte v laboratoři. Nejlepší způsob, jak toho dosáhnout, je oční mikrometr, přesná vložka oční čočky, která má pravítko vyryté do skla. Monokulární obory, které používáme v úvodních kurzech, nejsou tak vybaveny, proto použijeme alternativní metodu založenou na znalosti průměru zorného pole pro váš konkrétní mikroskop. Chcete-li to provést, musíte určit:

• přibližný průměr zorného pole vašeho malého zvětšení pro konkrétní mikroskop.
• celkové zvětšení pro každou z vašich dalších objektivů.

s tímto Vědomím na každý objektivu, můžete porovnat velikost vzorku proti známé oblasti průměru a udělat rozumné esimate velikosti. Tato technika funguje pro jakýkoli mikroskop.

1. Získejte měřítko snímku a umístěte jej na rozsah. Transparentní metrické pravítko bude také fungovat.

2. Zaměřte jej pomocí cíle 10x (celkem 100x). Stupnice jsou přírůstky 1 mm, jak je znázorněno na obrázku níže. Takže Černá lišta = 0,5 mm stejně jako mezera.

3. Posuňte snímek tak, aby okraj vnějšího černého pruhu byl právě tečný k osvětlenému poli (viz bod „a“ výše).

4. Počínaje tímto okrajem odhadněte, kolik pruhů a mezer je zapotřebí k překročení zorného pole. Pravděpodobně budete muset odhadnout Poslední zlomek mezery nebo pruhu. Pro většinu našich mikroskopů je široký přibližně 1,8 -2,0 mm. Musíte to zkontrolovat na jakémkoli mikroskopu, který používáte a který nemá oční mikrometr.

5. Zaznamenejte identifikační číslo svého rozsahu a průměr pole na 100x ve svém laboratorním notebooku pro budoucí použití.

6. Dále Vypočítejte šířku pole při celkovém zvětšení 430x pomocí následujícího vzorce (označujeme mag 100x jako „nízký výkon“ a 430x jako „vysoký výkon“):

(low power mag/ high power mag) x low power pole průměr (v mm)

předpokládejme například, že zjistíte, že 100x studijní průměr je 1,8 mm, na 430x, studijní průměr bude:

(100 / 430) x 1,8 mm = 0.418 mm = 418 um (mikrometrů)

Všimněte si, že studijní průměr na střední výkon je úměrný poměru nejnižší k nejvyšší moci cílů. To znamená, že když zvětšíte zvětšení, skutečné zorné pole se proporcionálně zmenší.

začátek stránky

H. binokulární složené světelné mikroskopy
části světelného mikroskopu

1. Oční čočka nebo okulár: naše jsou 10x zvětšení. Rozsahy, které použijeme, jsou binokulární (dva okuláry).

2. Tělesná trubice: obsahuje zrcadla a hranoly, které nasměrují obraz na oční čočky.

3. Nosepiece: drží objektivy, otáčí

4. Objektivy: obvykle 3-4 na našich oborech, 4x, 10x, 43x, 100x ponoření do oleje (červené pruhy). Celkové zvětšení = oční výkon x objektivní výkon. Většina našich dalekohledů má čočky s pevnou polohou-jeviště se pohybuje nahoru a dolů spíše než objektiv.

5. Fáze: pohyblivá plošina, na které jsou namontovány diapozitivy pro prohlížení; všechny naše obory mají mechanické stupně s X, Y vernier váhy. Zaostřovací knoflíky pohybují jevištěm nahoru a dolů.

6. Kondenzátor: substage objektiv, který zaostřuje světlo na vzorku. Naše dalekohledy mají kondenzátory, které se pohybují nahoru a dolů, aby zaostřily světelný paprsek.

7. Clona Duhovky: bránice se nachází těsně pod pódium a řídí množství světla, které prochází do vzorku a může výrazně ovlivnit zaostření obrazu.

8. Zaostřovací knoflíky: nejvzdálenější je jemné zaostření a nejvnitřnější je hrubé zaostření. Na dalekohledu tyto knoflíky ovládají pohyb jeviště nahoru/dolů.

9. Světelný zdroj: naše obory mají zabudované světelné zdroje. Spínač zapnutí/vypnutí reostatu je umístěn buď na rozsahu, nebo na externím napájecím zdroji a slouží k regulaci intenzity světla.

začátek stránky

i. zaostřovací postup: Binokulární složené mikroskopy

1. Zapněte světelný zdroj. Dalekohledy mají buď vestavěnou jednotku nebo externí napájení.

2. Přepněte na objektiv 10x.

3. Upravte hrubé zaostření tak, abyste zvedli kus nosu(nebo snížili stupeň).

4. Přiložte sklíčko vzorku na jeviště ve správné poloze.

5. Podívejte se na oční čočky vašeho rozsahu. Jedna čočka je pevná a druhá má zaostřovací kroužek (jako dalekohled). Přiveďte čočku co nejblíže k sklíčku, pak se dívejte pouze přes pevnou oční čočku, ustupte, dokud se vzorek nezaostří. Upravte jemné zaostření podobně pro pevný objektiv.

6. Nyní, při pohledu pouze přes nastavitelný oční, upravte jeho zaostření pomocí zaostřovacího kroužku kolem objektivu. Podívejte se oběma očima (upravte pro mezipupilární vzdálenost, abyste viděli jedno kulaté osvětlené pole) a proveďte drobné úpravy zaostření.

7. Vycentrujte obraz a upravte světlo pomocí kondenzační čočky, clony duhovky a reostatu zdroje světla.

8. Recenter a upravte zaostření, nejprve hrubé, pak jemné zaostření jako v 5.

9. Podle potřeby upravte membránu.

10.Nyní přepněte cíle na vyšší výkon. Podle potřeby upravte jemné zaostření a světlo (membránu).

Naše obory jsou parfocal což znamená, že při přepínání z nízkého na vysoký výkon, soustředěný obraz při nízkém výkonu zůstávají více či méně v zaměření na vyšší výkon. S největší pravděpodobností budete muset mírně upravit jemné zaostření a membránu (zvýšit světlo při vyšších výkonech.

Modified 11-6-15 gja

Department of Biology, Bates College, Lewiston, ME 04240