INTRODUCCIÓN

Los halófilos son un grupo interesante de organismos que prosperan a alta salinidad. Estos organismos pueden clasificarse ampliamente en función de su salinidad óptima para el crecimiento en halófilos leves (1-6%, p/v NaCl), halófilos moderados (7-15%) y halófilos extremos (15-30%) (Madigan y Martinko, 2006). Una extensa investigación ha demostrado que los halófilos no están restringidos a ninguno de los dominios de la vida, pueden ser eucariotas (Gunde-Cimerman et al., 2000; Zalar et al., 2005), o procariotas pertenecientes a los dominios de Bacterias y Arqueas. El género de algas Dunaliella y el camarón en salmuera Artemia (Boetius y Joye, 2009) son ejemplos de eucariotas halófilas, mientras que Halobacterium y Salinibacter son ejemplos de procariotas halófilas. El éxito de los halófilos en sobrevivir en ambientes altamente salinos se debe a adaptaciones fisiológicas únicas, como la estrategia de bombeo de iones y la acumulación de solutos orgánicos (Oren, 2006; Madigan y Martinko, 2006). A nivel genómico y proteómico, los halófilos se caracterizan por un alto contenido de GC y las proteínas se caracterizan por una baja hidrofobicidad, una sobre-representación de residuos ácidos, una menor propensión a la formación de hélices y una mayor propensión a la estructura de la bobina (Paul et al., 2008).

Los halófilos están ganando más acceso a la microbiología industrial y la biotecnología porque los halófilos crecen con una alta concentración de sal y esto minimiza el riesgo de contaminación durante el cultivo (Oren, 2006). Pocos ejemplos de aplicaciones biotecnológicas son el uso de Micrococcus varians para producir nucleasa H (Kamekura el al. 1982) y el uso de las halófitas Tetragenococcus cepas en la producción de salsa de soja y la producción de algunas enzimas como las hidrolasas (amilasas, nucleasas, proteasas, fosfatasas y) (Oren, 2006). Los halófilos también son importantes en la biodegradación y la biorremediación, ya que muchos halófilos son capaces de degradar hidrocarburos y otros compuestos tóxicos (Ventosa et al., 1998). Los halófilos también pueden producir polímeros utilizados como potenciadores de la recuperación de aceite debido a su actividad surfactante y propiedades bioemulsificantes (Oren, 2006).

Los halófilos florecen en entornos donde la salinidad alcanza altos niveles, como los océanos, las salinas solares y los lagos salados naturales (Oren, 2007). El mar Muerto de Jordania es uno de los lagos salados interiores hipersalinos más grandes del mundo (Boetius y Joye, 2009; Oren, 2007; Madigan y Martinko, 2006). Además de una alta salinidad; sal, concentración de más de 340 g L – 1 (Oren, 2007), el mar Muerto es único por su alta presión barométrica (800 mmHg) debido a una altitud muy baja por debajo del nivel del mar, presión parcial de oxígeno (PIO2) de un 8% más que a nivel del mar, radiación UV única, baja humedad (por debajo del 40%) y escasez de lluvia (Avriel et al., 2011).

Este estudio se realizó para clasificar las especies de bacterias heterotróficas halófilas que prosperan en la zona litoral del mar Muerto de Jordania. La clasificación microbiana se basa en la morfología colonial y celular, así como en la similitud del gen 16S rRNA.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo: Se recogieron muestras de agua del mar muerto de cuatro zonas litorales (Fig. 1) en marzo, junio y octubre de 2011. Las coordenadas geográficas y la elevación de los lugares de muestreo se muestran en el Cuadro 1. Las coordenadas geográficas y la elevación se determinaron para cada ubicación por (Leyenda C de eTrex, Taiwán). Las muestras de agua del mar muerto se recogieron en una botella de vidrio estéril limpia de 1 litro, dejando suficiente espacio para la cabeza en la botella, y se transportaron inmediatamente al laboratorio.

Análisis fisicoquímico de las muestras: Se determinó la Temperatura, el pH, los Sólidos Disueltos Totales (TDS) y la Demanda Biológica de Oxígeno (DBO) de las muestras de agua. La temperatura del agua, el pH y la salinidad se midieron in situ. La temperatura del agua y el pH se midieron con un medidor de pH portátil (medidor de pH de microordenador T19000, Trans Instruments). La salinidad se midió con un refractómetro portátil de salinidad. La DBO se midió en el Centro de investigación de Agua, Medio Ambiente y Regiones Áridas de la Universidad Al al-Bayt, Jordania. Las muestras de agua se transfirieron a una botella de vidrio nueva, luego se agregaron 1 mL de tampón de fosfato, sulfato de magnesio, cloruro de calcio y soluciones de cloruro de hierro por litro de muestra de agua. La muestra se llevó a una temperatura de 20±3 ° C y se saturó con aire filtrado sin orgánico. Se comprobó el pH de la muestra. Si la muestra no estaba en el rango de 6,5 a 7,5, se añadió ácido sulfúrico o hidróxido de sodio para llevar la muestra al rango de pH requerido (6,5 a 7,5) y la concentración añadida no diluyó la muestra más de 0,5%. La muestra se llevó a una temperatura de 20 ° C antes de hacer diluciones. El volumen adecuado de la muestra se transfirió a frascos de DBO. La botella se llenó con suficiente agua de dilución para desplazar todo el aire sin dejar burbujas. El oxígeno disuelto (DO) se determinó utilizando un analizador de DO y cualquier contenido desplazado se reemplazó con agua de dilución y tapón herméticamente. La botella se incubó durante 5 días a 20°C. Después de eso, se determinó la DO y se calculó la DBO siguiendo la diferencia entre la DO inicial y la final sobre el volumen.

Enriquecimiento, aislamiento y tinción de gram: Para enriquecer las muestras de agua, el agua del mar muerto (10 mL) se transfirió a 90 ml de medio líquido de alta salinidad y se incubó a 30°C en la oscuridad con agitación (100 rpm). Después de aproximadamente 12 h, un bucle de cultivo de enriquecimiento se rayó en un medio de sal mineral sólido modificado y las colonias separadas se subculturaron. También se prepararon y almacenaron reservas de glicerol de los aislados a -20°C para su posterior análisis. Las células fueron teñidas con Gram y examinadas bajo el microscopio.Secuenciación y análisis del gen del ARNr 16S: Macrogen Inc.realizó la amplificación y secuenciación de la secuencia del gen del ARNr 16S., Seúl, Corea, de acuerdo con el siguiente método: se suspendieron colonias jóvenes de cepas bacterianas en un tubo centrífugo de 1,5 mL que contenía 0,5 ml de solución salina estéril y luego se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos, se eliminó el sobrenadante y se suspendió el gránulo en 0,5 ml de Matriz InstaGene (Bio-Rad, EE.UU.) y se incubó a 56°C durante 30 minutos y luego se calentó a 100°C durante 10 minutos. Después del calentamiento, se utilizó sobrenadante para PCR. La PCR se llevó a cabo mezclando 1 µL de ADN de plantilla con 20 µL de solución de reacción PCR. Cebadores 27F / 1492R (27F: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, 1492R: 5 ‘ – TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) se utilizaron para amplificación y luego se realizaron 35 ciclos de amplificación a 94°C durante 45 segundos, 55°C durante 60 segundos y 72°C durante 60 segundos. Los productos purificados de PCR de aproximadamente 1,400 bp se secuenciaron con cebadores 518F / 800R (518F: 5’-CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG-3’, 800R: 5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3’). La secuenciación se realizó utilizando el kit de secuenciación del ciclo del terminador de tinte grande v.3.1 (Applied BioSystems, EE. UU.). Los productos de secuenciación se resolvieron en un sistema automatizado de secuenciación de ADN modelo 3730XL de Applied Biosystems (Applied BioSystems, EE. UU.) en Macrogen, Inc. Seúl , Corea.

Las secuencias se analizaron y compararon con la base de datos pública de nucleótidos utilizando el sitio web de BLAST de NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Las secuencias de los parientes más cercanos se recuperaron de la base de datos y se utilizaron para construir un árbol filogenético utilizando MEGA5 (Tamura et al., 2011). Las secuencias fueron calculadas por calculadora Oligo (http://mbcf.dfci.harvard.edu/docs/oligocalc.htmL).

RESULTADOS

Propiedades fisicoquímicas de las muestras: Las muestras de agua de mar muerto fueron muy salinas con un rango de (36-38%). Los valores de pH de las muestras fueron bajos y oscilaron entre 5,6 y 6,3. Esto indica la propiedad ligeramente ácida del agua de mar. Los valores de DBO fueron muy bajos (1-2 mg de O2 L-1), lo que indica un contenido de material orgánico muy bajo en la muestra. Las propiedades fisicoquímicas se muestran en la Tabla 2.Recuento bacteriano viable heterotrófico: Los resultados del recuento de placas viables revelaron un número muy bajo de unidades formadoras de colonias en cada muestra (200-6000 UFC mL-1). El recuento de UFC se muestra con más detalles en la Tabla 3.

Aislamiento y clasificación de bacterias heterotróficas halofílicas: En este estudio, hemos aislado 44 cepas bacterianas heterotróficas halofílicas. Once cepas de bacterias de 44 se consideraron diferentes según la morfología colonial, la tinción de Gram y la morfología celular. Siete de cada once cepas diferentes eran Gram positivas y 4 de 7 eran Gram negativas. Las cepas bacterianas se identificaron en base al análisis del gen 16S rRNA y se encontró que pertenecían al dominio de las bacterias. El pariente más cercano de cada cepa bacteriana aislada se muestra en la Tabla 4 y en la Fig. 2. Todas las secuencias mostraron un contenido de GC relativamente alto (hasta el 58%).

DISCUSIÓN

Se determinaron y analizaron las propiedades fisicoquímicas de las muestras de agua del mar muerto. El porcentaje de salinidad fue muy alto (hasta el 38%). Esta es una característica típica del agua del mar muerto, por lo que es una de las famosas salmueras “atalasohalinas” (Oren, 2007). Se encontró que el pH del agua del mar muerto era ligeramente ácido (5,6-6,3) en comparación con el pH (7,5-8) en salmueras talasohalinas (Oren, 2007). Los DBO de las muestras fueron muy bajos (1-2 mg de O2 L-1), reflejando un bajo contenido de materia orgánica en el agua que podría ser utilizado por bacterias heterotróficas. Estas condiciones fisicoquímicas, sin duda, afectan negativamente a la diversidad microbiana. Por lo tanto, el número de células viables en las muestras analizadas fue muy bajo (no más de 6 x 102 UFC mL-1) en comparación con el agua de mar abierto. Los recuentos de bacterias heterótrofas en aguas marinas suelen ser del orden de 105 a 106 bacterias mL-1 (Zweifel y Hagstrom, 1995; Madigan y Martinko, 2006). Estos números se derivan de técnicas de tinción fluorescente inespecíficas (Zweifel y Hagstrom, 1995) que generalmente dan números más altos que el método de recuento de placas viable. Las primeras publicaciones sobre el recuento de bacterias en el mar muerto se hicieron por microscopía. El número de la celda era de aproximadamente 1.9×106 células mL1 y durante una floración de halobacterias rojas, las densidades de población alcanzaron 1, 9×107, pero disminuyeron después de las polillas a 5×106 (Oren, 1983).

La investigación sobre organismos halófilos que habitan en el Mar Muerto comenzó a principios de 1892, cuando se aislaron bacterias del género Clostridium a partir de barro (Oren, 2002). Más tarde, en un breve artículo publicado en 1936, dio la primera descripción de una comunidad microbiana indígena adaptada a las condiciones extremadamente duras del mar Muerto (Oren y Ventosa, 1999). Desde entonces, nuestro conocimiento sobre los aspectos biológicos del mar Muerto se está expandiendo y acumulando. Llevamos a cabo esta investigación para ampliar nuestro conocimiento sobre las bacterias heterotróficas halófilas que prosperan en la zona litoral del mar Muerto jordano. Hemos aislado diferentes especies bacterianas. Posteriormente, aislamos e identificamos 11 especies diferentes de bacterias halófilas. La mayoría de los aislados fueron Gram-positivos (7 de 11). A pesar de que las bacterias Gram positivas poseen adaptaciones importantes, les permiten adaptarse al estrés ambiental, como la alta salinidad (Battistuzzi y Hedges, 2009). No está claro en la literatura si las bacterias Gram-positivas o las bacterias Gram-negativas son dominantes en ambientes hipersalinos. En un estudio sobre halófilos procarióticos recuperados de sedimentos del lago salado de El-Djerid en Túnez, Hedi et al. (2009) encontraron que la población bacteriana dominante pertenece a bacterias formadoras de esporas grampositivas.

Todas las cepas aisladas en este estudio pertenecen al dominio de las Bacterias. Pertenecen a 7 géneros diferentes en el dominio. Cinco de siete cepas bacterianas Gram positivas pertenecen al género Bacillus. Este género se estableció en 1872 para incluir tres especies, pero ahora hay 142 especies de Bacilos nombrados enumeradas en el Manual de Bacteriología Sistemática de Bergey (Logan y de Vos, 2009). Las cepas de bacilo son típicamente cepas del suelo. Las cepas de bacilos aisladas en este estudio pertenecen a las siguientes especies: B. licheniformis, B. pumilus, B. hwajinpoensis y B. cereus. Estas cepas se encontraron en diferentes ambientes salinos (Miranda et al., 2008; Parvathi et al., 2009; Yoon et al., 2004; Al-ZaZaee et al., 2011). Por ejemplo, B. licheniformis fue previamente recuperados de los sedimentos marinos por Miranda et al. (2008), mientras que B. pumilus fue aislado de organismos marinos como ostras, cangrejos y peces, además de sedimentos por Parvathi et al. (2009). B. hwajinpoensis se recuperó del agua de mar del mar Oriental y del mar Amarillo en Corea (Yoon et al., 2004). Y finalmente, B. cereus, una bacteria común del suelo, se encontró en aguas residuales, pero con propiedades halofílicas(Al-ZaZaee et al., 2011). Pared celular gruesa, alto contenido de peptidoglicanos (más del 90% de la pared celular) (Madigan y Martinko, 2006), alto contenido de GC y formación de esporas resistentes son las principales razones para la supervivencia del bacilo en condiciones duras como la alta salinidad. Cabe señalar que la cepa DSD32 (identificada como B. cereus) tiene una similitud muy baja con su pariente más cercano B. cereus. Esta cepa puede representar una nueva especie en el género Bacillus basada en el gen 16S rRNA.

Las otras dos bacterias grampositivas son cepas de Arthrobacter sp. y Kocuria rosea. Arthrobacter especies están ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en el suelo (Funke et al., 1996), pero no es muy común en ambientes hipersalinos. Kocuria rosea se considera una especie moderadamente halófila y se recuperó de diferentes ambientes salinos, como aguas salinas abiertas y poco profundas, y algunas cepas de Kocuria rosea crecen de manera óptima a una concentración de NaCl del 30% (Wright y Tanaka, 2002).

Las bacterias gram negativas fueron menos frecuentes en nuestras muestras (4 de 11). Sin embargo, la literatura publicada muestra que estos aislados no son infrecuentes en ambientes salinos. Una de las cepas aisladas fue identificada como Vibrio alginolyticus. Esta última especie es en realidad común en muestras marinas (Molitoris et al., 1985) y se encontró en agua de mar marina. La cepa tiene importancia médica porque puede causar infecciones complicadas de la piel y los tejidos blandos (Sganga et al., 2009). Más importante aún, se encontró que algunas cepas de Vibrio alginolyticus producen tetrodotoxina, una neurotoxina fuerte (Noguchi et al., 1987). Otra bacteria gramnegativa identificada en este estudio es Chromohalobacter salexigens. Esta especie se aisló primero y se describió como la especie moderadamente halófila Halomonas elongata y luego se propuso como nueva especie de Chromohalobacter (Arahal et al., 2001). Litoralis gaetbuli es otra de las especies identificadas en este estudio. Esta cepa tampoco es infrecuente para hábitats salinos. Fue aislado recientemente de la llanura de marea del mar amarillo en Corea y fue descrito como especie halófila por Yoon et al. (2005). La última cepa pertenece a Salinivibrio costicola. Esta especie fue descrita por primera vez como Vibrio costicola, pero sus características fenotípicas y genotípicas la distinguían de las especies del género Vibrio. Por lo tanto, la cepa se colocó en un nuevo género separado llamado Salinivibrio (Mellado et al., 1996). Salinivibrio costicola es moderadamente halofílico y se aisló originalmente de alimentos salados y crece de manera óptima en medios que contienen sales al 10% (Mellado et al., 1996). Un miembro del género Salinibacter, S. ruber, es un modelo interesante para el estudio de la adaptación de microorganismos a la vida a altas concentraciones de sal (Oren, 2007).

CONCLUSIÓN

El agua del mar muerto de la zona litoral se caracteriza por una alta salinidad, un pH bajo, un bajo contenido de material orgánico (DBO bajo) y restringe diferentes especies de bacterias heterotróficas pertenecientes a géneros Gram positivos y Gram negativos, incluidos Artrobacter, Kocuria, Vibrio, Salinivibrio, Cromohalobacter, Bacillus y Eritrobacter.

RECONOCIMIENTO

Este estudio fue apoyado por el decanato de investigación académica de la Universidad Al al-Bayt, Jordania, decisión del Consejo de Investigación Científica en la reunión número 2/2010/2011. Por lo tanto, el autor agradecería la asistencia financiera proporcionada por la Universidad.